CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Summary

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

Abstract

El sistema bacteriano de repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) /Streptococcus pyogenes crispr-associated protein (Cas) ha sido aprovechado por los investigadores para estudiar importantes problemas biológicamente relevantes. El poder incomparable del método de edición del genoma CRISPR / Cas permite a los investigadores editar con precisión cualquier locus de su elección, facilitando así una mayor comprensión de la función del gen. Anteriormente se han descrito varios métodos para editar el genoma de C. elegans por CRISPR/Cas9. Aquí, discutimos y demostramos un método que utiliza complejos de ribonucleoproteína ensamblados in vitro y el marcador co-CRISPR dpy-10 para la detección. Específicamente, en este artículo, pasamos por el proceso paso a paso de introducir codones de parada prematura en el gen C. elegans rbm-3.2 mediante reparación dirigida por homología utilizando este método de edición CRISPR / Cas9. Este método de edición relativamente simple se puede utilizar para estudiar la función de cualquier gen de interés y permite la generación de C. elegans editados homocigotos mediante edición CRISPR / Cas9 en menos de dos semanas.

Introduction

La tecnología clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) permite una edición eficiente del genoma dirigido en una amplia gama de organismos^1,2,3,4. El sistema CRISPR se descubrió por primera vez como parte de una respuesta inmune antiviral procariota^5,6,7. El sistema CRISPR tipo II utiliza una endonucleasa como Cas9, un ARN transactivante (tracrRNA) y un ARN CRISPR (crRNA) corto y específico del ADN objetivo de guía larga de 20 nucleótidos específicos del ADN (crRNA) para reconocer un motivo adyacente (PAM) del protoespaciador “NGG” y hacer una ruptura de doble cadena en el ADN objetivo^{5,6,7,8,9,10,11,12}. Esta rotura de doble cadena es reconocida como una lesión por la maquinaria de reparación del ADN celular. En consecuencia, la rotura de doble cadena generada puede ser reparada por una de dos vías: i) unión final no homóloga (NHEJ) o ii) reparación dirigida por homología (HDR)¹³. NHEJ es a menudo propenso a errores y, por lo tanto, cuando esta vía se utiliza para reparar la rotura de doble cadena en el ADN objetivo, a menudo causa mutaciones inactivantes (inserciones, deleciones) en el gen de interés. Por otro lado, al suministrar una plantilla de reparación exógena con homología a cada lado de la rotura de doble hebra, la maquinaria de reparación del ADN celular puede ser dirigida a usar HDR para reparar la rotura¹³. Por lo tanto, el método HDR permite la edición precisa de cualquier lugar de interés.

Se han descrito una variedad de protocolos de edición de genes CRISPR/Cas9 para C. elegans^{14,15,16,17,18,19,20}. Los métodos de edición CRISPR/Cas9 más comúnmente empleados en C. elegans incluyen protocolos basados en clonación y libres de clonación para generar plantillas de reparación para la edición CRISPR/Cas9^{14,15,16,17,18,19,20.} Este protocolo discute en detalle un protocolo de edición CRISPR/Cas9 libre de clonación basado en el uso de dpy-10 como marcador co-CRISPR para la detección. Hasta ahora, el único protocolo de edición de video CRISPR / Cas9 detallado centrado en C. elegansque existe utiliza un marcador fluorescente para la detección²¹. Sin embargo, el uso de un marcador fluorescente para la detección requiere acceso a un microscopio de fluorescencia, que muchos laboratorios en pequeñas instituciones principalmente de pregrado (PUI) pueden encontrar difícil de acceder. Es alentador observar que se han obtenido resultados correlativos positivos en estudios previos entre gusanos portadores de marcadores fluorescentes y la presencia de la edición^21,22. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para determinar la eficiencia general del método de detección basado en fluorescencia para editar una amplia variedad de loci con diferentes ARN guía y plantillas de reparación. Finalmente, dado que los plásmidos que codifican para estos marcadores fluorescentes forman matrices extracromosómicas, a menudo se produce fluorescencia variable a partir de estas matrices que pueden dificultar la identificación de positivos²³. Por lo tanto, aunque el método de detección basado en la fluorescencia puede ser útil para adoptar, los problemas mencionados anteriormente pueden limitar su aplicabilidad.

El uso de un marcador co-CRISPR que produce un fenotipo visible reduce en gran medida el número de progenie que deben ser examinadas para encontrar un gusano editado positivamente^{23,24,25,26,27,28}. Es importante destacar que los fenotipos que son producidos por estos marcadores pueden ser fácilmente detectados bajo un microscopio de disección simple^{23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.} El marcador co-CRISPR dpy-10 es uno de los marcadores co-CRISPR mejor caracterizados y ampliamente utilizados para realizar la edición del genoma CRISPR/Cas9 de C. elegans ^24,27. Por lo tanto, este artículo discutirá el método de realizar la edición CRISPR / Cas9 en C. elegans utilizando la entrega directa de complejos de ribonucleoproteínas con dpy-10 como un marcador co-CRISPR^27,35. En este método, la mezcla de inyección de edición preparada consiste en una plantilla de reparación de arncro dpy-10 y dpy-10 bien caracterizada para mediar en la generación de un fenotipo observable de “rodillo” dominante (Rol) que es conferido por una mutación heterocigota conocida de dpy-10 (cn64) dentro del gen dpy-10 ^24,27,29. Cuando está presente en su estado homocigoto, la mutación dpy-10(cn64) causa un fenotipo dumpy (Dpy) que produce gusanos más cortos y robustos^24,29. El fenotipo Rol está mediado por la inserción precisa de la plantilla de reparación dpy-10 co-suministrada en una sola copia del gen dpy-10 mediante edición CRISPR/Cas9 mediada por HDR. Por lo tanto, la aparición de Rol C. elegans indica una inyección exitosa, así como un evento de edición exitoso mediado por HDR dentro de las células del gusano inyectado. Dado que el crRNA y la plantilla de reparación del gen objetivo de interés están en la misma mezcla de inyección con la plantilla de reparación dpy-10 crRNA y dpy-10, existe una buena probabilidad de que los gusanos Rol identificados también se editaran simultáneamente en el gen objetivo de interés. Por lo tanto, estos gusanos Rol se examinan para la edición de interés mediante técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (para ediciones superiores a 50 pb) o mediante PCR seguida de digestión por restricción (para ediciones inferiores a 50 pb).

Las ventajas de utilizar este método para la edición del genoma son: i) las ediciones CRISPR se pueden generar a una eficiencia relativamente alta (2% a 70%) utilizando este método²⁷; ii) las plantillas de reparación y los ARN guía que se utilizan en este método no implican clonación, lo que reduce el tiempo requerido para su generación; iii) mediante el ensamblaje de complejos de ribonucleoproteínas in vitro,las concentraciones de los complejos de edición ensamblados pueden mantenerse relativamente constantes, mejorando así la reproducibilidad; iv) se ha demostrado que algunos ARN guía que no generan ediciones cuando se expresan a partir de plásmidos funcionan para la edición del genoma CRISPR / Cas9 cuando se suministran como CRRNAs transcritos in vitro ²⁷; v) la inclusión del marcador co-CRISPR dpy-10 permite un fácil cribado utilizando un microscopio de disección y disminuye el número de progenie que debe ser examinada para encontrar positivos^24,27; y vi) La secuenciación del ADN verificada de líneas de gusanos editadas homocigotamente se puede obtener por este método dentro de un par de semanas^19,27.

Se han publicado excelentes capítulos de libros pertenecientes a muchos métodos diferentes de C. elegans CRISPR^{14,15, 16,17,18,19,20,43.} Sin embargo, actualmente falta la demostración del método co-CRISPR dpy-10 en un formato de video en un entorno de laboratorio. En este artículo, describimos y demostramos el proceso de uso del método co-CRISPR dpy-10 para editar un gen objetivo representativo llamado rbm-3.2, una supuesta proteína de unión al ARN (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Específicamente, aquí describimos en detalle el método de introducción de tres codones de parada prematura dentro del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados in vitro y una plantilla de reparación lineal monocatenada suministrada exógenamente. Estos estudios han tenido éxito en la generación de la primera cepa CRISPR de C. elegans con codones de parada prematura en el gen rbm-3.2. Dado que actualmente no se sabe mucho sobre la función de este gen en C. elegans, esta cepa servirá como una herramienta útil para diseccionar la función de RMB-3.2. Este método también se puede adoptar para realizar inserciones, sustituciones y deleciones en cualquier locus dentro del genoma de C. elegans.

Protocol

Este protocolo para la edición del genoma CRISPR / Cas9 fue aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Tulsa siguiendo las pautas de los NIH. A lo largo de este protocolo se practicó la técnica estéril. Todos los pasos de este protocolo se llevaron a cabo utilizando reactivos libres de nucleasas. Se tuvo especial cuidado para evitar la contaminación por RNasa, como los guantes de limpieza, así como los espacios de trabajo y equipos (por ejemplo, pipetas, exteriores de cristalería, etc.) con una solución descontaminante RNasa. 1. diseño de crRNA Busque el PAM que permite que Cas9 corte más cerca del sitio de edición. El sitio PAM es 5′-NGG-3′. Recuerde que el PAM puede estar en cualquiera de las hebras del ADN. Seleccione 20 pb en el extremo 5′ del PAM como la secuencia de CRRNA.NOTA: La secuencia real de crRNA que sintetizan las empresas comerciales es más larga que 20 pb, ya que tiene una secuencia genérica adicional que la compañía sintetizadora agrega automáticamente a la secuencia de crRNA de 20 pb específica del objetivo. Con respecto a los efectos fuera del objetivo, estudios recientes no han encontrado efectos fuera del objetivo de Cas9 en C. elegans36,37,38,39,40. Además, las cepas resultantes editadas por CRISPR se cruzan. Por lo tanto, no estamos muy preocupados por los efectos fuera del objetivo de los ARNcr diseñados. Sin embargo, los sitios web en línea, incluidos http://genome.sfu.ca/crispr/ y http://crispor.tefor.net/, se pueden utilizar para encontrar y seleccionar los ARNcr con los menores efectos fuera del objetivo38,41. Se predice que los crRNAs que terminan con un G o GG y aquellos con más del 50% de contenido de GC serán más eficientes19,23,42. Solicite al menos 10 nmol del crRNA de una empresa (por ejemplo, IDT, Horizon Discovery, etc.). Una vez que llegue el CRRNA liofilizado, guárdelo a -30°C hasta el día de la microinyección. El día de realizar la microinyección, girar el ARNcr liofilizado a máxima velocidad (17.000 x g) durante un minuto y resuspedarlo en 5 mM Tris-Cl (pH 7,4) para hacer una media de 8 μg/μL del arNcr. Conservar el stock de ARNc no utilizado congelado a -80 °C. 2. Reparar el diseño de la plantilla Descargue un software de manipulación de secuencias (por ejemplo, visor de secuencias CLC, APE, Snapgene, Vector NTI, etc.). Utilizamos el visor de secuencias CLC versión 8.0 (Qiagen) ya que es fácil de usar y se puede descargar de forma gratuita. Pegue la secuencia del ADN objetivo de interés en el visor de secuencias. La orientación de la plantilla de reparación influye en la eficiencia de edición28. Para insertar una secuencia de reparación en el extremo 5′ del PAM, diseñe una plantilla de reparación de una sola cadena con secuencia de ADN de la misma cadena de ADN en la que se encuentra la secuencia PAM (hebra protoespaciadora)28. Mientras que para insertar una secuencia de reparación en el extremo 3′ del PAM, diseñe una plantilla de reparación de una sola cadena con secuencia de ADN de la cadena de ADN que no lleve la secuencia PAM (hebra espaciadora)28. Seleccione 35 pares de bases de secuencia con homología ininterrumpida en ambos lados (en el extremo 5′ y 3′) de la edición. Mutar o eliminar el PAM para evitar el corte de la plantilla de reparación o del ADN genómico editado por Cas9. Si la mutación del PAM no es posible, introduzca varias mutaciones silenciosas cerca del extremo 5′ del PAM para evitar el corte de la plantilla de reparación o del ADN genómico editado. Asegúrese de introducir solo mutaciones silenciosas del PAM si está presente en una región exónica. Compruebe la frecuencia de uso del codón para asegurarse de que el codón mutado se introduce a una frecuencia comparable al codón no mutado original (por ejemplo, https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). En algunos casos, es posible que no sea posible introducir el codón mutado a una frecuencia similar al codón no mutado. Sin embargo, para hacer mutaciones de unos pocos aminoácidos, no esperamos que el nivel de expresión de la proteína mutante se altere significativamente. Si la edición es pequeña (por ejemplo, mutación de unas pocas bases), introduzca un sitio de restricción único cerca de la edición por mutagénesis silenciosa. Utilizamos http://heimanlab.com/cut2.html para encontrar sitios de restricción que pueden ser introducidos por mutagénesis silenciosa. Compruebe la frecuencia de uso del codón para asegurarse de que el codón mutado se introduce a una frecuencia comparable al codón no mutado original. Como se indicó anteriormente, esto no siempre es posible. Sin embargo, para experimentos que involucran mutaciones de unos pocos aminoácidos, no esperamos que el nivel de expresión de la proteína mutante se altere significativamente. Sintetiza y compra plantillas lineales de reparación monocatenario para HDR como oligos de ultramer de 4 nmol. Vuelva a utilizar la plantilla de reparación de oligonucleótidos liofilizados en agua libre de nucleasas para hacer un stock de 1 μg/μL de la plantilla de reparación y guárdelo a -30 °C hasta su uso posterior. 3. Diseño de la imprimación de cribado Utilizando el visor de secuencia CLC u otras aplicaciones similares, diseñe de 20 a 23 pares de bases hacia adelante y hacia atrás a cada lado de la edición, respectivamente, de modo que produzcan una banda de entre 400 y 600 pares de bases tras la amplificación por PCR. Para inserciones más grandes que tienen varios kilobases de tamaño, diseñe la imprimación delantera para que se ubine justo afuera del brazo de homología izquierdo de la plantilla de reparación. Diseñe la imprimación inversa para que se encuentre dentro de la propia plantilla de reparación. En este caso, solo se obtendrá un producto de PCR en el caso de gusanos editados positivamente. Para identificar gusanos editados homocigotos para inserciones más largas, amplifique toda la región de la inserción diseñando cebadores hacia adelante y hacia atrás que se encuentren fuera de las uniones de inserción. Pruebe los cebadores y optimice las condiciones de PCR con ADN genómico de tipo salvaje antes de usar los cebadores para el genotipado. Asegúrese de que se produzca una sola banda del tamaño esperado tras la amplificación por PCR del ADN genómico (cuando corresponda). 4. Preparación de gusanos adultos jóvenes para inyección Elija L2-L3 etapa C. elegans en un césped bacteriano fresco en una placa MYOB e incube a 20 ° C durante la noche.NOTA: El protocolo para hacer placas MYOB se puede encontrar aquí: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ El día de la microinyección, elija gusanos adultos jóvenes con menos de 10 embriones en el útero para inyectar. 5. Preparación de la mezcla de inyección Prepare la mezcla de inyección en el mismo orden que se muestra en la Tabla 1 en tubos estériles libres de nucleasas.NOTA: Los componentes de la mezcla de inyección se pueden reducir para hacer mezclas de inyección de 5 μL (en lugar de 20 μL) si no se prevén futuras inyecciones con esta mezcla. Mezclar la mezcla de inyección mediante pipeteo. Incubar la mezcla de inyección a 37 °C durante 15 minutos para ensamblar complejos de ribonucleoproteínas. Girar la mezcla de inyección a 4 °C a 17.000 x g durante 5 minutos. 6. Microinyección en la gónada de C. elegans Realizar microinyección de la mezcla de inyección CRISPR en la gónada de C. elegans, como se describe en Iyer et al. 201943. Inyecte alrededor de 30 gusanos con la mezcla de inyección CRISPR. La mezcla de inyección no utilizada se puede reutilizar almacenándola a 4 °C durante un período de aproximadamente 6 meses sin pérdida de eficiencia49. Inyecte ambos brazos de gónada si es posible. Los gusanos inyectados se consideran la generación P0. 7. Recuperación y transferencia de gusanos inyectados Después de la microinyección, mueva los gusanos P0 microinyectados con un pico de gusano a una placa de agar MYOB de 60 mm secuestrada con OP50 E. coli y déjelos recuperarse a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Tenga en cuenta que la temperatura de recuperación dependerá del genotipo de los gusanos inyectados. Por ejemplo, para cepas sensibles a la temperatura, puede ser necesaria la recuperación de gusanos a una temperatura diferente. Usando una púa de gusano de alambre de platino, transfiera cada gusano inyectado a una sola placa de Petri de agar MYOB de 35 mm con semillas y permítales poner huevos a 20 ° C hasta el díasiguiente. Tenga en cuenta que algunos gusanos morirán como resultado de una lesión del procedimiento de microinyección. Solo elige aquellos gusanos que están vivos y exhiben movimiento. Después de 24 horas, transfiera los gusanos inyectados a nuevas placas individuales (1 gusano por placa). 8. Picking C. elegans para cribado De 3 a 4 días a 20 ° C después de que se realizó la inyección, controle todas las placas que contienen la progenie de los gusanos inyectados con un microscopio de disección. Identifique las placas que tienen fenotipos de progenie F1 que exhiben rodillos (Rol) y dumpy (Dpy). Un fenotipo Dpy es cuando los gusanos parecen más cortos y robustos que los gusanos de control en la misma etapa de desarrollo (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). Las placas con gusanos Rol y Dpy representan placas donde la progenie F1 ha sido editada con éxito con la mutación dpy-10(cn64) para estar presente en su estado heterocigoto u homocigoto, respectivamente. Elija las placas con la mayoría de los gusanos rodillos y dumpy para la detección. Señale de 50 a 100 gusanos F1 Rol de estas placas a sus propias placas individuales (1 gusano por placa) y permítales poner huevos. Permita que los gusanos F1 Rol con etapa L4 ponen huevos y producen progenie (F2) durante 1 a 2 días. 9. Lisis de un solo gusano y PCR Después de producir F2 durante 1 a 2 días, transfiera cada madre F1 Rol individualizada a 2,5 μL de tampón de lisis (Tabla 2) con una dilución de 1:100 de 20 mg/ml de proteinasa K. Congelar los tubos a -30 °C durante 20 minutos. Los gusanos se pueden almacenar en esta etapa durante un período prolongado hasta un análisis adicional. Realice una lisis de un solo gusano en un termociclador de PCR con las siguientes condiciones: 60 °C durante 1 hora, 95 °C durante 15 min y mantener a 4 °C. Agregue los siguientes reactivos directamente a 2,5 μL del gusano lisado que contiene el tubo de PCR: 12,5 μL de mezcla de PCR 2x que contiene dNTP, ADN polimerasa, MgCl2 y colorante de carga, 1 μL de imprimación hacia adelante de 10 μM, 1 μL de imprimación inversa de 10 μM y agua estéril a 22,5 μL. El volumen total de cada reacción de PCR es de 25 μL.NOTA: En caso de cribado de múltiples gusanos F1, es más rápido y más conveniente hacer una mezcla maestra de PCR para múltiples reacciones y agregar 22.5 μL de la mezcla maestra a cada tubo de lisis. Configure reacciones de PCR en un termociclador con las siguientes condiciones: 95 °C durante 1 minuto, 35 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 15 s (optimizar para cada conjunto de imprimación), 72 °C durante 1 minuto (optimizar para cada ADN objetivo)44. Mantenga las reacciones a 4 °C. 10. Digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa NOTA: Una digestión de restricción solo es necesaria mientras se detecn pequeñas ediciones (menos de 50 pb). Transfiera 10 μL del ADN de PCR del paso 9 a un nuevo tubo. Añadir entre 2 y 4 unidades de enzima de restricción y 1 tampón de enzima de restricción (1,5 μL de tampón de reacción 10x) por reacción de 15 μL. Incubar a 37 °C (o a otra temperatura específica de la enzima) durante 2 horas (pueden ser posibles tiempos de incubación más cortos con enzimas de acción rápida). El calor inactiva la digestión de restricción calentando los tubos de PCR a 65 °C (u otra temperatura específica de la enzima) durante 10 a 15 minutos. Cargue toda la reacción de cada tubo de PCR en un solo pozo de un gel de agarosa al 1% -2% y ejecute el gel a 110 mA hasta que se logre la separación adecuada de la banda.NOTA: Utilizamos una mezcla de PCR que ya tiene un tinte de carga incluido para la visualización mientras se ejecuta en un gel de agarosa. Esta mezcla no interfiere con la reacción de digestión de restricción y, por lo tanto, es conveniente de usar para detectar muchos gusanos a la vez. 11. Identificar gusanos editados positivamente Visualice los geles de agarosa bajo luz UV (para geles de bromuro de etidio) para detectar los tamaños de las bandas de ADN.NOTA: Los gusanos editados positivamente mostrarán una banda adicional de ADN en el tamaño esperado debido a la edición utilizando la plantilla de reparación que lleva el sitio de restricción en el locus deseado dentro del genoma del gusano. Se espera que los gusanos de rodillo F1 sean heterocigotos para la edición y, por lo tanto, se espera que exhiban tres bandas (un producto de PCR sin cortar de tipo salvaje y dos fragmentos más pequeños del producto de PCR de corte editado). Aunque es raro, debe tenerse en cuenta que los homocigotos surgen ocasionalmente. Guarde todas las placas originales editadas positivamente hasta que la presencia de la edición sea verificada por la secuenciación de Sanger. 12. Edición homocigosa de interés Elija entre 8 y 12 gusanos F2 no rodantes de aspecto salvaje de las respectivas placas de gusano F1 Rol editadas positivamente y permítales poner huevos y producir progenie durante 1 a 2 días.NOTA: Dado que C. elegans son hermafroditas autofertilizantes, si el alelo editado no afecta la viabilidad o el desarrollo, la proporción de mutantes homocigotos esperados debe ser de aproximadamente el 25%. Los gusanos F2 no rodantes deben ser de tipo salvaje para el locus dpy-10. La selección de gusanos no rodantes permite la generación de gusanos editados que han perdido la mutación dpy-10 (cn64) y solo tienen la mutación en su gen de interés. Tenga en cuenta que el gen dpy-10 está presente en el cromosoma II. Si su gen de interés está vinculado a dpy-10,es posible que no pueda separar fácilmente la mutación dpy-10 de su gen de interés. Realice los pasos 9 a 11 para identificar líneas de gusanos homocigotos. 13. Confirme la edición por secuenciación Una vez que se identifican los gusanos homocigotos, realice la lisis y la PCR como se describe en el paso 9. Configure al menos 3 reacciones de PCR para cada línea homocigota a secuenciar. Purificar las reacciones de PCR utilizando un kit de purificación de PCR. Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro nanodrop. Envíe la muestra con la imprimación delantera respectiva para la secuenciación de Sanger. Asegúrese de que la imprimación delantera esté diseñada para estar al menos a 50 bases de distancia de la edición que se va a secuenciar. Analice los resultados de la secuenciación utilizando un software de análisis de secuencia para confirmar la presencia de la edición.

Representative Results

rbm-3.2 es una supuesta proteína de unión al ARN que tiene homología con la variante tau de la subunidad 2 del factor de estimulación de escisión humana (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). La proteína RBM-3.2 fue identificada como un socio de unión de la Proteína Fosfatasa 1 (GSP-1) y sus reguladores Inhibidor-2 (I-2SZY-2)y SDS-22 en un estudio previo que identificó estas proteínas como nuevos reguladores de la duplicación centriolo de C. elegans (datos no mostrados)45. En la actualidad, se sabe muy poco sobre la función del gen rbm-3.2 en C. elegans. Por lo tanto, para investigar más a fondo el papel biológico del gen C. elegans rbm-3.2, se obtuvo el alelo rbm-3.2-nulo rbm-3.2(ok688) del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC). Desafortunadamente, además de poseer una deleción de todo el gen rbm-3.2, el alelo rbm-3.2 (ok688) también resulta en una deleción parcial de un gen superpuesto, rbm-3.1, lo que complica el análisis genético. Por lo tanto, con el fin de investigar con precisión el papel del gen rbm-3.2 en C. elegans, utilizamos la edición CRISPR / Cas9 para introducir tres codones de parada prematura muy cerca del inicio de la región codificante de C. elegans rbm-3.2, dejando intacto el gen rbm-3.1 superpuesto. Para introducir estos codones de parada prematura en el gen C. elegans rbm-3.2, diseñamos un crRNA con un motivo PAM que se encontraba en la hebra opuesta (hebra plantilla) de ADN (Figura 1A). El sitio de corte de Cas9 se ubicó a 6 bases del codón de inicio rbm-3.2 ATG. Para introducir codones de parada prematuros en el gen rbm-3.2, diseñamos una plantilla de reparación con las siguientes cinco características principales: 1) 35 bases de homología ininterrumpida a rbm-3.2 aguas arriba del codón de inicio rbm-3.2 (brazo de homología izquierdo) 2) Se eliminó un corto tramo de bases que contenía el motivo PAM 3) Se introdujo un sitio de restricción EcoRI inmediatamente después del codón de inicio para la detección 4) Se eliminaron el segundo y el tercer codones de rbm-3.2 y se introdujeron tres codones de parada después del quinto codón RBM-3.2 para detener la traducción del ARNm-3.2 5) Se incluyeron 35 bases de homología ininterrumpida al primer intrón de rbm-3.2 aguas abajo de la edición (brazo de homología derecha) (Figura 1B). La mezcla de inyección para este experimento CRISPR se preparó como se indica en la Tabla I. La mezcla de inyección se incubó a 37 °C durante 15 minutos para ensamblar complejos de ribonucleoproteínas. La mezcla se centrifugaba y se cargaba en la aguja de microinyección tirada. La microinyección en la gónada de C. eleganse realizó como se describe en Iyer et al. 201943. La Figura 2 muestra la línea de tiempo experimental para generar C. elegans editados utilizando este protocolo. Aunque normalmente inyectamos 30 gusanos para cada experimento CRISPR, algunos laboratorios inyectan menos gusanos (entre 10 y 20) para cada experimento CRISPR. Dado que inyectar más gusanos aumenta la probabilidad de encontrar ediciones positivas, preferimos inyectar un mayor número de gusanos. Muchos laboratorios eligen crías “jackpot” (placas con más del 50% de progenie Rol y Dpy) para la detección. En nuestra experiencia después de realizar varios experimentos CRISPR, aunque las crías de jackpot surgen ocasionalmente, la mayoría de las veces, los gusanos Rol que se recogen para la detección a menudo provienen de muchas placas P0 diferentes, cada una de las que consiste en unas pocas progenie Rol. No se obtuvieron crías de jackpot en este experimento. En total, se cribó el ADN genómico de 73 gusanos F1 Rol que se obtuvieron de 7 gusanos P0 inyectados para detectar la presencia de la edición. Las secuencias de los cebadores de cribado y sus ubicaciones con respecto al codón de inicio del gen rbm-3.2 están representadas en la Figura 3A. A través de nuestro análisis, se encontró que 7 de los 73 gusanos F1 eran positivos para la edición (9.5%) (Figura 3B). Los gusanos sin editar mostraron un solo fragmento de ADN de 445 pb en la digestión ecori. Mientras que, los gusanos portadores de un codón de parada prematura en el gen rbm-3.2 exhibieron dos fragmentos de 265 pb y 166 pb respectivamente en la digestión EcoRI. Los gusanos editados heterocigotos mostraron tres fragmentos en la digestión EcoRI: un fragmento de ADN sin editar de tipo salvaje de 445 pb y dos fragmentos de ADN de 265 pb y 166 pb respectivamente de la copia editada del gen rbm-3.2. Para identificar gusanos portadores de ediciones homocigotas, transferimos 12 gusanos F2 de los heterocigotos F1 positivos identificados a nuevas placas individuales y les permitimos producir progenie (F3). Los gusanos F2 fueron examinados para detectar homocigosidad como se describió anteriormente. Se encontró que 6 de los 12 (50%) gusanos examinados eran homocigotos para nuestra edición de interés (Figura 4A). El ADN genómico de una línea de gusanos homocigota identificada se utilizó para establecer una reacción de secuenciación de ADN. El análisis de secuenciación de ADN confirmó la presencia de la edición en su estado homocigoto (Figura 4B). En general, es beneficioso secuenciar múltiples líneas de gusanos homocigotos para garantizar que todas las líneas de gusanos editadas homocigotas exhiban el mismo fenotipo (si la mutación nula produce un fenotipo específico). Además, también podría ser necesario validar los knockouts de genes utilizando un ensayo basado en la expresión, como western blotting o RT-PCR o mediante análisis de fenotipos. Esto se debe a que, a pesar de introducir codones de parada prematura al comienzo del gen, un ATG alternativo podría estar presente aguas abajo de los codones de parada prematura. Este ATG podría usarse para iniciar la expresión de proteínas, lo que resulta en una proteína truncada parcialmente funcional. Reactivo Concentración Volumen para agregar Proteína Cas9 en agua libre de nucleasas con 20% de glicerol 2 μg/μL 5 μL tracrRNA en 5 mM Tris-Cl pH 7.5 4 μg/μL 5 μL dpy-10 crRNA en 5 mM Tris-Cl pH 7.5 8 μg/μL 0,4 μL rbm-3.2 crRNA en 5 mM Tris-Cl pH 7.5 8 μg/μL 1 μL Plantilla de reparación dpy-10 en agua estéril libre de nucleasas 500 ng/μL 0,55 μL Plantilla de reparación rbm-3.2 en agua estéril libre de nucleasas 1 μg/μL 2,2 μL KCl en agua estéril libre de nucleasas 1 M 0,5 μL agua estéril libre de nucleasas – 5,35 μL Tabla 1: Componentes de la mezcla de inyección para la edición CRISPR/Cas9 utilizando complejos de ribonucleoproteína y dpy-10 como marcador co-CRISPR. Use técnicas estériles y reactivos libres de RNasa mientras hace la mezcla de inyección. Tenga en cuenta que se utilizó agua estéril sin nucleasa tratada con DEPC para hacer la mezcla de inyección. Reactivo Concentración Volumen para agregar Kcl 1 M 5 ml Tris-HCl pH 8.3 1 M 1 ml MgCl2 1 M 250 μL NP-40 (o IGEPAL CA-630) 100% 450 μL Preadolescente-20 100% 450 μL Gelatina 2% 500 μL Agua – 92,35 ml Tabla 2: Receta de tampón de lisis de gusanos. El tampón de lisis de gusanos se puede hacer a granel, en autoclave, filtrado y aliquoted para almacenamiento a largo plazo (NOTA: el tampón de lisis se puede almacenar durante más de un año a temperatura ambiente). Agregue una dilución de 1:100 de 20 mg/ml de proteinasa K al tampón de lisis de gusanos justo antes de cada uso. Figura 1: Esquema que muestra crRNA y diseño de plantilla de reparación para rbm-3.2 parada prematura CRISPR. A. Esquema que muestra las hebras de codificación y plantilla del gen rbm-3.2 con la secuencia de crRNA y la secuencia de motivos PAM ubicada en la hebra de plantilla. B.Esquema que representa las diferentes características de la plantilla de reparación que se sintetizó para introducir tres codones de parada prematura en el gen rbm-3.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Línea de tiempo experimental para la generación de C. elegans homocigoto editado por CRISPR/Cas9 utilizando complejos de ribonucleoproteína preensamblados y dpy-10 como marcador co-CRISPR. Un desglose día a día de los pasos que deben realizarse para generar C. elegans editados homocigotos utilizando este método de edición CRISPR/Cas9. Brevemente, se inyectaron 30 gusanos con la mezcla de edición CRISPR utilizando microinyección y se segregaron en placas MYOB individuales secuembadas con OP50 E. coli. Después de 24 horas, los gusanos P0 inyectados se transfirieron a nuevas placas MYOB frescas y se les permitió continuar poniendo huevos. En los días 3 y 4 después de la microinyección, las placas se examinaron para detectar la presencia de gusanos Rol F1. Se seleccionaron las placas con el número máximo de gusanos Rol y Dpy F1 y se seleccionaron 73 gusanos F1 Rol (generalmente elegimos entre 50 y 100 gusanos F1 Rol por experimento CRISPR) se unieron a nuevas placas MYOB individuales (1 gusano por plato) y se les permitió poner huevos durante aproximadamente 2 días. El día 6 después de la microinyección, se prepararon lisados de lombriz a partir de los gusanos F1 que habían producido progenie (F2)y se examinaron para detectar la presencia de la edición por PCR seguida de digestión de restricción con EcoRI y electroforesis en gel de agarosa. El día 7, 12 gusanos no Rol, no Dpy F2 fueron transferidos de las placas positivas a nuevas placas individuales y se les permitió producir progenie (F3). El día 9, los gusanos F2 fueron examinados para detectar la homocigosidad de la edición como se describió anteriormente. El día 10, se realizó una limpieza de lisis de gusanos, PCR y PCR para los gusanos homocigotos F3 y se midió la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. El día 11, se configuraron reacciones de secuenciación de Sanger para muestras positivas y las reacciones se enviaron para la secuenciación de ADN. El día 12, se analizaron los resultados de la secuenciación y se verificó la presencia de la edición utilizando un software de análisis de secuencia (por ejemplo, visor de secuencia CLC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Detección de C. elegans que son heterocigotos para los codones de parada prematura rbm-3.2. Imágenes de electroforesis en gel de agarosa del ADN de PCR genómico de C. elegans digerido con EcoRI. 73 gusanos F1 individuales fueron genotipados y examinados para detectar la presencia de la edición rbm-3.2. Los números rojos y los asteriscos indican gusanos editados positivamente. Los 7 C. elegans identificados positivamente editados fueron heterocigotos para la edición, ya que exhibieron un fragmento de ADN sin editar de tipo salvaje de 445 pb y dos fragmentos de ADN de 265 pb y 166 pb respectivamente de la copia editada del gen rbm-3.2 en la digestión EcoRI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Identificación y verificación de C. elegans homocigotos editados por los codones de parada prematura rbm-3.2. A. Detección de C. elegans que son homocigotos para los codones de parada prematura rbm-3.2 . Imágenes de electroforesis en gel de agarosa del ADN genómico de C. elegans digerido con EcoRI. 12 gusanos F2 individuales de placas positivas fueron genotipados y examinados para detectar homocigosidad de la edición rbm-3.2. Rojo: gusanos homocigotos editados. 6 de los 12 gusanos F2 examinados (50%) eran homocigotos para los codones de parada prematura rbm-3.2. No hubo ningún producto de PCR presente para el gusano 7. B. Confirmación de la inserción de los codones de parada prematura en rbm-3.2 mediante secuenciación de ADN. Esquema que muestra la comparación de secuencias de ADN y proteínas de homocigotos no editados y editados. El análisis de los resultados de la secuenciación del ADN genómico de gusanos homocigotos confirmó la presencia de los tres codones de parada prematuros en el gen rbm-3.2 tras la edición CRISPR/Cas9. Todos los cambios de aminoácidos resultantes después de la edición CRISPR / Cas9 se indican en letras rojas o asteriscos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hemos utilizado el protocolo anterior para editar varios genes además de rbm-3.2. Nuestras eficiencias de edición para diferentes loci, ARN guía y plantillas de reparación (monocatenario y doble cadena) han variado entre el 2% y el 58% (datos no mostrados). Las eficiencias de edición observadas son comparables a las eficiencias de edición reportadas anteriormente del 2% al 70% para este protocolo²⁷. También hemos tenido éxito en el uso de esta técnica en la realización de deleciones de genes. Usando dos crRNAs reemplazamos un gen que tiene una longitud cercana a los 6 kb con la secuencia codificante para la proteína fluorescente verde (GFP) (datos no mostrados). Para este experimento, se encontró que alrededor del 14% de los gusanos Rol F₁ que se analizaron eran positivos para la deleción del gen y el reemplazo con GFP (datos no mostrados). Sin embargo, se requieren experimentos adicionales para determinar la longitud máxima de las deleciones y reemplazos de genes que se pueden realizar utilizando esta técnica.

Esta técnica se puede utilizar para realizar inserciones que tienen aproximadamente 1,6 kb de longitud^19. Un estudio reciente ha demostrado que para realizar inserciones de más de 1,6 kb de longitud utilizando este protocolo, generar dos roturas de doble cadena y utilizar plantillas de reparación con brazos de homología más largos puede permitir la inserción de fragmentos mucho más grandes de ADN (~10 Kb)²⁸. Alternativamente, se pueden realizar múltiples rondas de edición de genes con este protocolo para generar ediciones más grandes. Otros protocolos de edición de genes CRISPR/Cas9 basados en plásmidos basados en plásmidos también pueden adoptarse para experimentos CRISPR que impliquen la inserción de fragmentos de ADN mayores de 1,6 kb^46,47,48.

Antes de utilizar este protocolo para la edición de genes, es necesario asegurarse de que el gen de interés no esté vinculado al locus dpy-10 en el cromosoma II. En el caso de que un gen objetivo esté vinculado a dpy-10,puede ser problemático separar la mutación dpy-10 de su edición de interés. De ahí que, en el caso de que el gen de interés esté ligado al locus dpy-10, se podrán utilizar otros marcadores co-CRISPR como unc-58 (cromosomaX), unc-22 o zen-4 (cromosomaIV), y ben-1 o pha-1 (cromosoma III) que se localizan en diferentes cromosomas^24,25,26,28. Los datos del laboratorio de Meyer demuestran que las mutaciones ben-1 y zen-4 se pueden utilizar como marcadores co-CRISPR exitosos para el cribado con este método²⁸. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el uso de zen-4 y pha-1 como marcadores co-CRISPR requiere realizar el experimento CRISPR en fondos zen-4 (cle10ts) o pha-1 (e2123ts) de tipo no salvaje respectivamente^26,28. Además, los experimentos CRISPR que involucran algunos marcadores co-CRISPR como ben-1 pueden requerir la preparación de placas especiales (por ejemplo, placas que contienen benzimidazol)²⁸. Hemos utilizado con éxito el marcador co-CRISPR unc-58 para detectar ediciones positivas para un gen que está vinculado al dpy-10 utilizando este método (datos no mostrados). La mutación unc-58(e665) confiere un fenotipo visible (parálisis) que puede ser utilizado eficazmente para detectar gusanos editados positivamente²⁴. Alternativamente, si se dispone de acceso a un microscopio fluorescente, también se puede utilizar un gen gtbp-1 marcado fluorescentemente como marcador co-CRISPR para este protocolo¹⁹.

Para una alta eficiencia de edición mientras se utiliza este método de edición del genoma, el sitio de edición debe estar dentro de 10 a 30 bases desde el sitio de corte Cas9. Si el sitio de edición está a más de 30 bases del sitio de corte Cas9, la eficiencia de edición disminuye drásticamente^19,35,37. Sin embargo, un estudio reciente del laboratorio meyer ha demostrado que la creación de dos roturas de doble hebra a distancia entre sí puede permitir la inserción de ediciones lejos del sitio de corte Cas9 utilizando este protocolo²⁸.

En el protocolo actual, la plantilla de reparación se diseñó para que los tres codones de parada insertados aparezcan en el mismo marco de lectura. Sin embargo, una estrategia alternativa para crear mutantes nulos sería utilizar un casete STOP-IN universal de 43 bases de largo que se ha descrito anteriormente^50. Es importante destacar que este casete tiene codones de parada en los tres marcos de lectura posibles y causa mutaciones de desplazamiento de marco. Esta es una estrategia especialmente útil para generar mutantes nulos cuando se produce una reparación incorrecta o incompleta en el sitio de edición.

En conclusión, debido a su corta duración y los recientes avances en este método, este es un método excelente para experimentos de laboratorio de rutina que implican la adición de etiquetas de epítopo inmunogénico corto, etiquetas fluorescentes, haciendo deleciones de genes, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Premixed	N/A
Cas9 protein	PNA Bio	CP01	Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	N/A	Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI	New England Biolabs	R3101S	Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit	Qiagen	28004	Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix	Meridian Bioscience	BIO-25043	Stored at -30 °C
Primers	IDT	N/A	Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K	Gold Bio	P-480-SL4	Stored at -30 °C
Repair template oligos	IDT	N/A	4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	U-002005-50	Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C