Undersöka aortaklaffförkalkning via isolering och kultur av T-lymfocyter med hjälp av matarceller från bestrålad buffyrock

Summary

I denna studie beskriver vi processen för T lymfocyt isolering från färska prover av förkalkade aorta ventiler och analytiska steg av T cell-kloning för karakterisering av adaptiva leukocyte undergrupper med hjälp av flöde cytometry analys.

Abstract

Calcific kolorektal ventil sjukdom (CAVD), en aktiv sjukdom process som sträcker sig från mild förtjockning av ventilen till allvarlig förkalkning, är associerad med hög dödlighet, trots nya terapeutiska alternativ såsom transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR).

De kompletta vägarna som börjar med ventil förkalkning och leder till allvarliga aorta stenos förblir endast delvis förstådda. Genom att tillhandahålla en nära representation av aorta valve cellerna in vivo, kan analysen av T lymfocyter från stenotic ventil vävnad vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i utvecklingen av förkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeras det färska kolorektalventilprovet i små bitar och T-lymfocyterna odlas, klonas och analyseras sedan med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).

Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan också fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. Resultaten från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-cellkoncentrationer över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundertyper av intresse. I denna studie visar vi isolering av T-celler, utförs på färska förkalkade aorta ventil prover och stegen för att analysera T cell kloner med flöde cytometry att ytterligare förstå rollen av adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.

Introduction

Calcific aorta ventil sjukdom (CAVD) är en av de vanligaste hjärtklaff störningar, med en stor inverkan på hälso-och sjukvården. Frekvensen av aortaklaffbyten under de senaste åren har ökat dramatiskt och förväntas öka ytterligare på grund av den växande äldre ^{befolkningen1}.

Den underliggande patofysiologi av CAVD är endast delvis känd och de nuvarande terapeutiska strategierna är begränsade till konservativa åtgärder eller kolorektal ventil ersätter, antingen genom kirurgiska eller perkutan förfaranden. Hittills kan ingen effektiv medicinsk behandling hindra eller vända CAVD progression och hög dödlighet är associerad med tidig symptom-debut, om inte aorta ventil ersättning (AVR) ^utförs2. Hos patienter med svår symptomatisk aorta stenos rapporterades den 3-åriga symptomfria överlevnaden så låg som 20%³. Transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR) representerar ett nytt alternativ, revolutionerande behandling för högriskpatienter, särskilt bland äldre och har dramatiskt minskat dödligheten, som var i sig hög i denna ^{population4,5,6}. Trots de lovande resultaten av TAVR är ytterligare forskning nödvändig för att förstå CAVD patofysiologi för att identifiera nya tidiga terapeutiska ^mål7,8,9.

Tidigare tros vara en passiv, degenerativ process, CAVD är nu erkänd som en aktiv progressiv sjukdom, kännetecknas av en osteoblastic fenotyp switch av aorta ventil interstitial ^celler10. Denna sjukdom innebär progressiv mineralisering, fibrokala förändringar och minskad motilitet av kolorektal ventil broschyrer (skleros), som i slutändan hindrar blodflödet leder till förträngning (stenos) av kolorektal ^{ventilöppning11}.

Inflammation anses vara en nyckelprocess i CAVD patofysiologi, som liknar processen med vaskulär åderförkalkning. Endotelskada möjliggör deponering och ackumulering av lipidarter, särskilt oxiderade lipoproteiner i kolorektalventilen12. Dessa oxiderade lipoproteiner provocerar ett inflammatoriskt svar, eftersom de är cytotoxiska, med den inflammatoriska aktiviteten som leder till mineralisering. Rollen av medfödd och adaptiv immunitet i CAVD utveckling och sjukdomsprogression har nyligen belysts13. Aktivering och klonurvalet expansion av specifika delmängder av minne T-celler har dokumenterats hos patienter med CAVD och mineraliserade aorta valve broschyrer, så att inflammatoriska processer antas vara inblandade åtminstone i utvecklingen av CAVD och förmodligen i sjukdomsprogression ^samt14. Faktum är att även om antigen-presentera celler och makrofager finns i både friska och sjuka ventilen, är förekomsten av T lymfocyter vägledande för en åldring och sjuk aorta ventil. Denna lymfatiska infiltrate tillsammans med en ökning av neovascularization och metaplasi är karakteristiska histologiska tecken på ^CAVD15.

Vi t ställa hypotesen förekomsten av en interaktion mellan aorta ventil interstitial celler och aktivering av immunsystemet, som potentiellt utlöser inledandet av en kronisk inflammatorisk process i aorta ventilen. Analys av T-celler från stenotic aorta ventil vävnad kan vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i förkalkning utveckling, eftersom det kan ge en nära representation av aorta ventilceller in vivo. I det nuvarande arbetet, med hjälp av kolorektal ventil vävnad, isolerar vi T-lymfocyter, kultur och klonar dem, och därefter karakterisera dem med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Färska aorta valve prover togs bort från CAVD patienter som fick kirurgiska ventil ersätter för allvarliga aorta stenos. Efter kirurgiska excision dissekerades den färska ventilprovet i små bitar och T-cellerna odlades, klonades sedan analyseras med hjälp av flöde cytometri. Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. De data som genereras från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-lymfocytfördelning över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundergrupper av intresse.

Extraktion av förkalkad vävnad, isolering av leukocyter från förkalkad vävnad och särskilt användningen av flödescytometri på denna typ av vävnad kan vara utmanande på grund av problem som autofluorescens. Få publikationer finns med protokoll för detta specifika ändamål16,17,18. Häri presenterar vi ett protokoll utformat speciellt för direkt isolering och kultur av T lymfocyt från mänskliga aorta ventil prover. Klonisk expansion av lymfocyter är ett kännetecken för adaptiv immunitet. Att studera denna process in vitro ger insiktsfull information om nivån av lymfocyt ^{heterogenitet19}. Efter en inkubationsperiod på tre veckor är T-cellsklonerna redo att explanteras, eftersom en tillräcklig mängd T-celler från varje klon erhölls, så att den fenotypiska och funktionella studien kan tillåtas. Därefter studeras fenotypen av T kloner av cytofluorometri.

Detta immunologiska protokoll är en anpassning av en metod som tidigare utvecklats av Amedei et al. för T-cellsisolering och karakterisering från mänsklig vävnad, särskilt utformad för förkalkad mänsklig vävnad, såsom i CAVD20,21,22. Protokollet här för isolering av PBMCs (perifera blod mononukleära celler) med hjälp av bestrålade buffy coat beskriver ett effektivt sätt att erhålla matare celler (FC), särskilt justerat för kloning fasen av T lymfocyter isolerade från ventil interstitiella celler. Matarskiktet består av tillväxt arresterade celler, som fortfarande är livskraftiga och bioaktiva. Matarcellernas roll är viktig för att stödja överlevnad och tillväxt av T-lymfocyter isolerade från ventilinterstitiella ^celler23. För att undvika spridning av matarceller i kulturen måste dessa celler genomgå ett tillväxtstopp. Detta kan uppnås på två sätt: genom fysiska metoder som bestrålning, eller genom behandling med cytotoxiska kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), ett antitumoralt antitumoral antibiotikum som kan appliceras direkt på ^{odlingsytan24}. Här visar vi feeder cell tillväxt arrest uppnås genom cell bestrålning.

Denna metod presenterar ett effektivt, kostnadseffektivt sätt att isolera och karakterisera T-celler från aorta ventil vävnad, bidrar till att bredda spektrumet av immunologiska metoder för att utforska CAVD patofysiologi.

Protocol

Studien genomfördes i enlighet med stadgan för Charité for Ensuring Good Scientific Practice och de rättsliga riktlinjerna och bestämmelserna om integritet och etik respekterades. Etikkommittén godkände alla mänskliga experiment och patienternas integritet och anonymitet bibehölls i enlighet med de regler som rapporterades på etikformen. OBS: För protokollet som beskrivs nedan användes färska mänskliga stenotic ventil prover. 1. Reagensberedning …

Representative Results

Vi använde en enkel och kostnadseffektiv metod för att karakterisera leukocytpopulationen av färska aorta ventil prover härrör från mänskliga patienter med allvarliga aorta ventil stenos (se protokollet). Metoden för att isolera PBBC är ett viktigt steg för att erhålla matningsceller, som används i varje steg i experimentet (kloning, återmatning och klyvningsfaser) och möjliggör detektion och karakterisering av infiltrerande leukocyter i aortaklaffprover. De viktigaste stegen i den här metoden visas i <st…

Discussion

Här presenterar vi en metod för att karakterisera T lymfocyt subpopulationer isolerade från stenotic aorta ventil prover, med hjälp av flöde cytometry. Denna metod kräver användning av bestrålad buffy coat för att isolera PBMCs. Den strålningsfrekvens som de buffy coat bags måste utsättas för är 9000 Rad/90 Gray (Gy) och det utgör ett avgörande steg för att stoppa spridningen av matarcellerna. Rollen för de celler som isoleras från de buffy coat bags är att fungera endast som matarceller och ge närin…

Materials

50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801