Studio della calcificazione della valvola aortica tramite isolamento e coltura di linfociti T utilizzando cellule feeder da Buffy Coat irradiato
Summary
In questo studio, descriviamo il processo di isolamento dei linfociti T da campioni freschi di valvole aortiche calcificate e le fasi analitiche della clonazione delle cellule T per la caratterizzazione dei sottoinsiemi di leucociti adattivi utilizzando l’analisi citometrica a flusso.
Abstract
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD), un processo di malattia attivo che va dal lieve ispessimento della valvola alla calcificazione grave, è associata a un’elevata mortalità, nonostante le nuove opzioni terapeutiche come la sostituzione della valvola aortica transcatetere (TAVR).
I percorsi completi che iniziano con la calcificazione valvolare e portano a una grave stenosi aortica rimangono solo parzialmente compresi. Fornendo una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo, il dosaggio dei linfociti T dal tessuto valvolare stenotico potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione. Dopo l’escissione chirurgica, il campione di valvola aortica fresca viene sezionato in piccoli pezzi e i linfociti T vengono coltivati, clonati e quindi analizzati utilizzando la selezione cellulare attivata a fluorescenza (FACS).
La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono anche essere riparati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I risultati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nelle concentrazioni delle cellule T nel tempo in relazione all’intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottotipi di cellule T di interesse. In questo studio, mostriamo l’isolamento delle cellule T, eseguito su campioni di valvola aortica calcificata fresca e le fasi di analisi dei cloni di cellule T utilizzando la citometria a flusso per comprendere ulteriormente il ruolo dell’immunità adattativa nella fisiopatologia CAVD.
Introduction
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è uno dei disturbi valvolari cardiaci più comuni, con un forte impatto sull’assistenza sanitaria. La frequenza di sostituzione della valvola aortica negli ultimi anni è aumentata drasticamente e si prevede che aumenterà ulteriormente, a causa della crescente popolazione anziana1.
La fisiopatologia sottostante della CAVD è solo parzialmente nota e le attuali strategie terapeutiche sono limitate a misure conservative o alla sostituzione della valvola aortica, sia attraverso procedure chirurgiche che percutanee. Ad oggi, nessun trattamento medico efficace può ostacolare o invertire la progressione della CAVD e un’elevata mortalità è associata all’insorgenza precoce dei sintomi, a meno che non venga eseguita la sostituzione della valvola aortica (AVR)2. Nei pazienti con stenosi aortica sintomatica grave, la sopravvivenza libera da sintomi a 3 anni è stata riportata a partire dal 20%3. La sostituzione transcatetere della valvola aortica (TAVR) rappresenta una nuova opzione, rivoluzionando il trattamento per i pazienti ad alto rischio, specialmente tra gli anziani e ha ridotto drasticamente la mortalità, che era intrinsecamente alta in questa popolazione4,5,6. Nonostante i risultati promettenti della TAVR, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere la fisiopatologia della CAVD per identificare nuovi bersagli terapeutici precoci7,8,9.
Precedentemente pensato per essere un processo passivo e degenerativo, la CAVD è ora riconosciuta come una malattia progressiva attiva, caratterizzata da un interruttore fenotipico osteoblastico delle cellule interstiziali della valvola aortica10. Questa malattia comporta una progressiva mineralizzazione, cambiamenti fibrocalcifici e una ridotta motilità dei foglietti della valvola aortica (sclerosi), che alla fine ostruiscono il flusso sanguigno portando al restringimento (stenosi) dell’apertura della valvola aortica11.
L’infiammazione è considerata un processo chiave nella fisiopatologia CAVD, simile al processo di aterosclerosi vascolare. La lesione endoteliale consente la deposizione e l’accumulo di specie lipidiche, in particolare lipoproteine ossidate nella valvola aortica12. Queste lipoproteine ossidate provocano una risposta infiammatoria, in quanto citotossiche, con l’attività infiammatoria che porta alla mineralizzazione. Il ruolo dell’immunità innata e adattativa nello sviluppo della CAVD e nella progressione della malattia è stato recentemente evidenziato13. L’attivazione e l’espansione clonale di specifici sottoinsiemi di cellule T di memoria sono state documentate in pazienti con CAVD e lembi valvolari aortici mineralizzati, in modo che si presume che i processi infiammatori siano coinvolti almeno nello sviluppo di CAVD e presumibilmente anche nella progressione della malattia14. Infatti, sebbene le cellule e i macrofagi che presentano l’antigene siano presenti sia nella valvola sana che in quella malata, la presenza di linfociti T è indicativa di una valvola aortica invecchiata e malata. Questo infiltrato linfocitico insieme ad un aumento della neovascolarizzazione e della metaplasia sono segni istologici caratteristici di CAVD15.
Ipotizziamo l’esistenza di un’interazione tra le cellule interstiziali della valvola aortica e l’attivazione del sistema immunitario, che potenzialmente innesca l’avvio di un processo infiammatorio cronico nella valvola aortica. Il dosaggio delle cellule T dal tessuto della valvola aortica stenotica potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione, in quanto può fornire una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo. Nel presente lavoro, utilizzando il tessuto valvolare aortico, isoliamo i linfociti T, li colturamo e li cloniamo e successivamente li caratterizziamo utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Campioni freschi di valvola aortica sono stati asportati da pazienti con CAVD che hanno ricevuto la sostituzione chirurgica della valvola per stenosi aortica grave. Dopo l’escissione chirurgica, il campione di valvola fresco è stato sezionato in piccoli pezzi e le cellule T sono state coltivate, clonate e poi analizzate utilizzando la citometria a flusso. La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono essere fissati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I dati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nella distribuzione dei linfociti T nel tempo in relazione all’intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottoinsiemi di cellule T di interesse.
L’estrazione del tessuto calcificato, l’isolamento dei leucociti dal tessuto calcificato e in particolare l’uso della citometria a flusso su questo tipo di tessuto possono essere impegnativi, a causa di problemi come l’autofluorescenza. Esistono poche pubblicazioni con protocolli per questo scopo specifico16,17,18. Qui presentiamo un protocollo progettato specificamente per l’isolamento diretto e la coltura di linfociti T da campioni di valvola aortica umana. L’espansione clonale dei linfociti è un segno distintivo dell’immunità adattativa. Lo studio di questo processo in vitro fornisce informazioni approfondite sul livello di eterogeneità dei linfociti19. Dopo un periodo di incubazione di tre settimane, i cloni di cellule T sono pronti per essere espiantati, in quanto è stata ottenuta una quantità adeguata di cellule T da ciascun clone, in modo da consentire lo studio fenotipico e funzionale. Successivamente il fenotipo dei cloni T viene studiato mediante citofluorometria.
Questo protocollo immunologico è un adattamento di un metodo precedentemente sviluppato da Amedei et al. per l’isolamento e la caratterizzazione delle cellule T da tessuto umano, appositamente progettato per il tessuto umano calcificato, come in CAVD20,21,22. Il protocollo qui per l’isolamento delle PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) utilizzando il buffy coat irradiato descrive un modo efficace per ottenere cellule feeder (FC), specificamente regolate per la fase di clonazione dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari. Lo strato di alimentazione è costituito da cellule arrestate dalla crescita, che sono ancora vitali e bioattive. Il ruolo delle cellule feeder è importante per supportare la sopravvivenza in vitro e la crescita dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari23. Al fine di evitare la proliferazione delle cellule di alimentazione in coltura, queste cellule devono subire un arresto della crescita. Ciò può essere ottenuto in due modi: attraverso metodi fisici come l’irradiazione o attraverso il trattamento con sostanze chimiche citotossiche, come la mitomicina C (MMC), un antibiotico antitumorale che può essere applicato direttamente sulla superficie di coltura24. Qui mostriamo l’arresto della crescita delle cellule di alimentazione ottenuto attraverso l’irradiazione cellulare.
Questo metodo presenta un modo efficiente ed economico per isolare e caratterizzare le cellule T dal tessuto valvolare aortico, contribuendo ad ampliare lo spettro dei metodi immunologici per esplorare la fisiopatologia CAVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo un metodo per caratterizzare le sottopopolazioni di linfociti T isolate da campioni di valvola aortica stenotica, utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo richiede l’uso di buffy coat irradiato per isolare i PBMC. La frequenza di radiazione a cui devono essere sottoposte le borse buffy coat è di 9000 Rad/90 Gray (Gy) e rappresenta un passo cruciale per arrestare la proliferazione delle cellule di alimentazione. Il ruolo delle cellule isolate dai sacchetti di buffy coat è quello di agire solo co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tutti i sacchetti di buffy coat utilizzati per questo protocollo sono stati irradiati grazie alla disponibilità del Dr. Peter Rosenthal, del Dr. Dirk Böhmer e di tutto il team del Dipartimento di Radiologia di Charité Benjamin Franklin. Borsista / Mary Roxana Christopher, questo lavoro è supportato da una borsa di studio della German Cardiac Society (DGK).
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: “on-label” versus “off-label” use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of “Not Effector” T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ –adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
