조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사
Summary
이 연구에서는, 우리는 유동 세포 분석분석을 사용하여 적응성 백혈구 하위 집합의 특성화를 위한 T 세포 복제의 신선한 견본 및 T 세포 복제의 분석 단계에서 T 림프구 절연의 과정을 기술합니다.
Abstract
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD), 밸브의 온화한 두껍게에서 심한 석회화에 이르기까지 활성 질병 과정, 고체 대동맥 판막 교체 (TAVR)와 같은 새로운 치료 옵션에도 불구하고, 높은 사망률과 연관된다.
밸브 석회화로 시작하여 심각한 대동맥 협착증으로 이어지는 전체 경로는 부분적으로만 이해됩니다. 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공함으로써, 스테노판 막부 조직에서 T 림프구의 분석은 석회화의 발달에 있는 그들의 역할을 명확히 하는 능률적인 방법이 될 수 있었습니다. 수술 후, 신선한 대동맥 판막 시료는 작은 조각으로 해부되고 T 림프구가 배양되고 복제된 다음 형광 활성 세포 분류(FACS)를 사용하여 분석합니다.
염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 염색 패널에서 생성된 결과는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 세포 농도의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 관심의 특정 T 세포 아류형의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다. 이 연구에서는, 우리는 새로운 석회화 대동맥 판막 샘플과 CAVD 병리생리학에서 적응성 면역의 역할을 더 이해하기 위해 유동 세포 세포를 분석하는 단계와 T 세포 클론에 수행 T 세포의 절연을 보여줍니다.
Introduction
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 가장 흔한 심장 판막 질환 중 하나이며 의료에 큰 영향을 미칩니다. 지난 몇 년 동안 대동맥 판막 교체의 빈도가 급격히 증가하고 있으며, 고령인구가 증가함에 따라 더욱 증가할 것으로 예상됩니다1.
CAVD의 근본적인 병리생리학은 부분적으로만 알려져 있으며 현재 치료 전략은 외과 또는 경피 적 절차를 통해 보수적 인 조치 또는 대동맥 판막 교체로 제한됩니다. 현재까지, 어떤 효과적인 치료도 CAVD 진행을 방해하거나 되돌릴 수 없으며 높은 사망률은 대동맥 판막 교체(AVR)가 수행되지 않는 한 초기 증상 발병과 관련이 있습니다2. 심한 증상 대동맥 협착증 환자에서 3 년 증상없는 생존은 20%3으로 낮게 보고되었습니다. Transcatheter 대동맥 판막 교체 (TAVR)는 새로운 옵션을 나타냅니다, 고위험 환자에 대한 치료를 혁명, 특히 노인 중 극적으로 사망률을 감소했다, 이는 본질적으로 이 인구4,5,6. TAVR의 유망한 결과에도 불구하고, 새로운 초기 치료 목표를 확인하기 위해 CAVD 병리 생리학을 이해하기 위해 추가 연구가 필요합니다7,8,9.
이전에는 수동적이고 퇴행성 공정으로 여겨졌던 CAVD는 이제 대동맥 판막 간질 세포의 골세포 표현형 스위치를 특징으로 하는 활성 진행성 질환으로 인식되고 있다10. 이 질병은 진행성 광물화, 섬유질 변화 및 대동맥 판막 전단지 (경화증)의 감소 된 운동성을 포함하며 궁극적으로 대동맥 판막 개구부의 협착 (협착)으로 이어지는 혈류를 방해합니다11.
염증은 혈관 동맥 경화증의 과정과 유사한 CAVD 병리 생리학의 중요한 과정으로 간주됩니다. 내피 손상은 지질 종, 특히 대동맥 판막12에서 산화 지단백질의 증착 및 축적을 가능하게합니다. 이러한 산화 지단백질은 염증 반응을 유발, 그들은 세포 독성으로, 미네랄화로 이어지는 염증 활성. CAVD 개발 및 질병 진행에서 선천적이고 적응성 면역의 역할이 최근 강조되고 있다13. 메모리 T 세포의 특정 하위 집합의 활성화 및 복제 확장은 CAVD 및 광물화 대동맥 판막 전단지 환자에서 문서화되어 염증 과정이 적어도 CAVD의 개발에 관여하는 것으로 가정되고 아마도 질병 진행에 관여할 수 있도록14. 사실, 항원 제시 세포및 대식세포는 건강하고 병든 판막둘다 존재하더라도, T 림프구의 존재는 노인과 병든 대동맥 판막을 나타낸다. 이 림프구성은 신생아와 대사의 증가와 함께 침투하는 것은 CAVD15의 특징적인 조직학적 징후이다.
우리는 대동맥 판막 간질 세포와 면역 계통의 활성화 사이의 상호 작용의 존재를 가설, 이는 잠재적으로 대동맥 판막에서 만성 염증 과정의 개시를 트리거. 스테노성 대동맥 판막 조직에서 T 세포의 분석은 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공 할 수 있기 때문에 석회화 발달에서 자신의 역할을 명확히하는 효율적인 방법이 될 수 있습니다. 본 작업에서, 대동맥 판막 조직을 사용하여, 우리는 T-림프구를 분리하고, 배양하고 복제하고, 그 후에 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 그(것)들을 특성화합니다. 신선한 대동맥 판막 샘플은 중증 대동맥 협착증에 대한 외과 용 판막 교체를받은 CAVD 환자로부터 절제되었습니다. 수술 후, 신선한 판막 샘플은 작은 조각으로 해부되었고 T 세포는 배양되었고, 그 후 유동 세포 측정을 사용하여 분석하였다. 염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 스테닝 패널에서 생성된 데이터는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 림프구 분포의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 특정 T 세포 하위 집합의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다.
석회화 된 조직의 추출, 석회화 된 조직에서 백혈구의 분리 및 특히 조직의이 유형에 유동 세포종의 사용은 자동 형광과 같은 문제로 인해 어려울 수 있습니다. 이 특정 목적에 대한 프로토콜이 존재하는 간행물은 거의 없습니다16,17,18. 본 발명에서는 인간 대동맥 판막 시료로부터 T 림프구의 직접 절연 및 배양을 위해 특별히 설계된 프로토콜을 제시한다. 림프구의 클로날 확장은 적응성 면역의 특징입니다. 시험관 에서이 과정을 연구 림프구 이질성의 수준에 통찰력있는 정보를 제공합니다19. 3주 간의 인큐베이션 기간 이후에, T 세포 클론은 각 클론으로부터 적절한 양의 T 세포를 얻어서, 표현성 및 기능적 연구를 허용하도록 하여 배분할 준비가 되어 있다. 그 후 T 클론의 표현형은 세포성 평성에 의해 연구된다.
이러한 면역 학적 프로토콜은 이전에 Amedei 외에 의해 개발 된 방법의 적응이다 T 세포 격리 및 인간 조직에서 특성화, 특히 CAVD20,21,22에서와 같은 석회화 인간 조직을 위해 설계. 조사된 버피 코트를 이용한 PBMC(말초 혈액 단핵세포)의 분리를 위한 프로토콜은 밸브 간질 세포로부터 분리된 T 림프구의 복제 상을 위해 특별히 조정된 피더 세포(FC)를 얻는 효과적인 방법을 설명합니다. 피더 층은 여전히 실행 가능하고 생리활성인 성장 체포 된 세포로 구성됩니다. 피더 세포의 역할은 밸브 간질 세포23에서 분리된 T 림프구의 체외 생존 및 성장을 지원하는 것이 중요합니다. 배양에서 피더 세포 확산을 피하기 위해, 이러한 세포는 성장 체포를 받아야한다. 이는 조사와 같은 물리적 방법을 통해, 또는 미토마이신 C(MMC)와 같은 세포독성 화학물질로 치료를 통해 배양 표면에 직접 적용될 수 있는 항종양 항생제24로 달성될 수 있다. 여기서 우리는 세포 조사를 통해 달성 된 피더 세포 성장 체포를 보여줍니다.
이 방법은 대동맥 판막 조직에서 T 세포를 분리하고 특성화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제시하여 CAVD 병리생리학을 탐구하기 위한 면역 학적 방법의 스펙트럼을 넓히는 데 기여합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 는 유동 세포측정법을 사용하여 스테노성 대동맥 판막 시료로부터 분리된 T 림프구 하위 모집단을 특성화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 조사 된 버피 코트를 사용하여 PBMC를 격리해야합니다. 버피 코트 백이 반드시 복종해야 하는 방사선 주파수는 9000 Rad/90 Gray(Gy)이며 피더 세포의 증식을 중단하는 중요한 단계를 나타냅니다. 버피 코트 백에서 분리 된 세포의 역할은 피더 세포로만 작…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜에 사용된 모든 버피 코트 백은 피터 로젠탈 박사, 더크 뵈머 박사, 샤리테 벤자민 프랭클린 방사선학과 전체 팀의 가용성 덕분에 조사되었습니다. 장학금 소지자 / 메리 록사나 크리스토퍼,이 작품은 독일 심장 학회 (DGK)에서 장학금에 의해 지원됩니다.
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
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