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Bio-ingénierie

Un système in vitro pour évaluer l’efficacité thrombolytique de l’histotripsie et d’un médicament lytique

Published: June 04, 2021
doi:
10.3791/62133
, ,
1Department of Radiology,University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics,University of Chicago

Summary

L’accouchement lytique assisté par histotripsie ou lysotripsie est en cours de développement pour le traitement de la thrombose veineuse profonde. Une procédure in vitro est présentée ici pour évaluer l’efficacité de cette thérapie combinée. Les principaux protocoles pour le modèle de caillot, les conseils d’image et l’évaluation de l’efficacité du traitement sont discutés.

Abstract

La thrombose veineuse profonde (TVPH) est un problème de santé mondial. La principale approche pour obtenir la recanalisation des vaisseaux pour les obstructions critiques est la thrombolytique dirigée par cathéter (CDT). Pour atténuer les effets secondaires caustiques et la longue durée du traitement associée à la TDC, des approches adjuvantes et alternatives sont en cours de développement. L’une de ces approches est l’histotripsie, une thérapie par ultrasons focalisés pour ablater les tissus via la nucléation des nuages de bulles. Des études précliniques ont démontré une forte synergie entre l’histotripsie et les thrombolytiques pour la dégradation des caillots. Ce rapport décrit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité du traitement thrombolytique assisté par histotripsie, ou lysotripsie.

Des caillots fabriqués à partir de sang veineux humain frais ont été introduits dans un canal d’écoulement dont les dimensions et les propriétés acousto-mécaniques imitent une veine iliofémorale. Le canal a été perfusé avec du plasma et l’activateur lytique recombinant de type tissulaire plasminogène. Des nuages de bulles ont été générés dans le caillot avec une source d’ultrasons focalisée conçue pour le traitement des caillots veineux fémoraux. Des positionneurs motorisés ont été utilisés pour traduire le foyer source le long de la longueur du caillot. À chaque emplacement d’insonation, les émissions acoustiques du nuage de bulles ont été enregistrées passivement et formées par faisceau pour générer des images de cavitation passive. Les mesures permettant d’évaluer l’efficacité du traitement comprenaient la perte de masse de caillots (efficacité globale du traitement) et les concentrations de D-dimère (fibrinolyse) et d’hémoglobine (hémolyse) dans le perfusate. Cette conception in vitro présente des limites, notamment le manque de moyens pour évaluer les effets secondaires in vivo ou les changements dynamiques du débit à mesure que le caillot se lyse. Dans l’ensemble, la configuration fournit une méthode efficace pour évaluer l’efficacité des stratégies basées sur l’histotripsie pour traiter la TVC.

Introduction

La thrombose est l’état de formation de caillots dans un vaisseau sanguin par ailleurs sain qui obstrue la circulation1,2. La thromboembolie veineuse a un coût annuel des soins de santé de 7 à 10 milliards de dollars, avec 375 000 à 425 000 cas aux États-Unis3. L’embolie pulmonaire est l’obstruction de l’artère pulmonaire et est la conséquence la plus grave de la thromboembolie veineuse. La principale source d’obstruction pulmonaire est le thrombus veineux profond, principalement à partir des segments veineux iliofémoraux4,5,6. La thrombose veineuse profonde (TVV) a des séquelles inhérentes en plus des obstructions pulmonaires, avec des complications à long terme qui entraînent de la douleur, de l’enflure, des ulcérations de la jambe et des amputations de membres7,8,9. Pour les obstructions critiques, les thrombolytiques dirigés par cathéter (CDT) sont l’approche de première ligne pour la recanalisation des vaisseaux10. Le résultat de la CDT dépend d’un certain nombre de facteurs, y compris l’âge du thrombus, l’emplacement, la taille, la composition, l’étiologie et la catégorie de risque du patient11. De plus, la TDC est associée à des lésions vasculaires, des infections, des complications hémorragiques et une longue durée de traitement10. Les dispositifs de nouvelle génération visent à combiner la thrombectomie mécanique avec des thrombolytiques (c.-à-d. thrombectomie pharmacomécanique)12,13. L’utilisation de ces dispositifs réduit la posologie lytique, ce qui réduit les complications hémorragiques et raccourcit le temps de traitement12,13,14 par rapport à la CDT. Ces dispositifs conservent encore des problèmes d’effets secondaires hémorragiques et d’élimination incomplète des thrombuschroniques 15. Une stratégie adjuvante est donc nécessaire pour éliminer complètement le thrombus avec des complications hémorragiques plus faibles.

Une approche potentielle est le traitement thrombolytique assisté par histotripsie, appelé lysotripsie. L’histotripsie est une modalité de traitement non invasive qui utilise des ultrasons focalisés pour nucléer les nuages de bulles dans les tissus16. L’activité des bulles n’est pas générée par des noyaux exogènes, mais par l’application d’impulsions ultrasonores avec une tension suffisante pour activer les noyaux intrinsèques aux tissus, y compris le caillot17,18. L’oscillation mécanique du nuage de bulles confère une contrainte au caillot, désintégrant la structure en débris acellulaires19. L’activité des bulles d’histotripsie permet une dégradation efficace des caillots sanguins rétractés et non rétractés à la fois in vivo et in vitro20,21,22. Des études antérieures ont démontré23,24 que la combinaison de l’histotripsie et de l’activateur plasminogène de type tissulaire recombinant lytique (rt-PA) augmente significativement l’efficacité du traitement par rapport au lytique seul ou à l’histotripsie seule. On émet l’hypothèse que deux mécanismes principaux associés à l’activité de la bulle d’histotripsie sont responsables de l’amélioration de l’efficacité du traitement: 1) augmentation de la fibrinolyse due à l’amélioration de l’administration lytique, et 2) hémolyse des globules rouges dans le caillot. La majeure partie de la masse du caillot est composée de globules rouges24, et, par conséquent, le suivi de la dégradation des érythrocytes est un bon substitut pour l’ablation de l’échantillon. D’autres éléments de caillot formés sont également probablement désintégrés sous l’activité de bulle d’histotripsie, mais ne sont pas pris en compte dans ce protocole.

Ici, une approche de paillasse pour traiter la TVP in vitro avec lysotripsie est décrite. Le protocole décrit les paramètres de fonctionnement critiques de la source d’histotripsie, l’évaluation de l’efficacité du traitement et le guidage par image. Le protocole comprend la conception d’un canal d’écoulement pour imiter un segment veineux iliofémoral et la fabrication de caillots de sang total humain. La procédure expérimentale décrit le positionnement de la source d’histotripsie et du réseau d’imagerie pour obtenir une exposition à l’histotripsie le long du caillot placé dans le canal d’écoulement. Des paramètres d’insonation pertinents pour atteindre la perturbation des caillots et minimiser l’activité des bulles hors cible sont définis. L’utilisation de l’imagerie par ultrasons pour le guidage et l’évaluation de l’activité des bulles estillustrée 24. Les mesures permettant de quantifier l’efficacité du traitement, telles que la perte de masse des caillots, le D-dimère (fibrinolyse) et l’hémoglobine (hémolyse), sont décrites23,24,25,26,27. Dans l’ensemble, l’étude fournit un moyen efficace d’exécuter et d’évaluer l’efficacité de la lysotripsie pour traiter la TVP.

Protocol

Pour les résultats présentés ici, du sang humain veineux a été prélevé pour former des caillots après approbation du comité d’examen interne local (CISR no 19-1300) et consentement éclairé écrit fourni par des donneurs bénévoles24. Cette section décrit un protocole de conception pour évaluer l’efficacité de la lysotripsie. Le protocole est basé sur un travail antérieur de Bollen et al.24. 1. Modélisation des caillots <p …

Representative Results

Le protocole décrit dans cette étude met en évidence les détails de la modélisation des caillots veineux, de la lysotripsie pour la perturbation des caillots et de l’imagerie échographique dans une configuration in vitro de TVP. La procédure adoptée démontre les étapes nécessaires pour évaluer la perturbation des caillots due aux effets combinés de la rt-PA et de l’activité des nuages de bulles d’histotripsie. La configuration de la paillasse a été conçue pour imiter les caractéristiques d’une v…

Discussion

Le protocole proposé présente un modèle pour quantifier l’efficacité du traitement de la lysotripsie. Bien que les détails clés aient été discutés, il y a certains aspects critiques à considérer pour le succès de ce protocole. L’activité enzymatique de rt-PA a une dépendance de température d’Arrhenius30. La température est également un facteur contribuant à la vitesse du son dans l’eau et les tissus, et les variations de température peuvent entraîner des modifications m…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par les National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Haworth pour son aide au test de Drabkin et le Dr Viktor Bollen pour son soutien dans la conception du protocole. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Adam Maxwell pour ses conseils sur la conception de la source d’histotripsie.

Materials

Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"
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References

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. . Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -. T., Huang, C. -. Y., Hsu, C. -. P., Lee, C. -. Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -. C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A., Duck, F. A. . Physical Properties of Tissues. , 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

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Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).
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