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Bio-ingénierie

組織組織の血栓溶解性の有効性と溶解薬を測定するインビトロシステム

Published: June 04, 2021
doi:
10.3791/62133
, ,
1Department of Radiology,University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics,University of Chicago

Summary

肝トリプシー支援溶解性分娩またはリソトリプシーは、深部静脈血栓症の治療のために開発中である。この併用療法の有効性を評価するために、インビトロの手順をここに提示する。血栓モデル、画像ガイダンス、および治療有効性の評価のための主要なプロトコルについて議論する。

Abstract

深部静脈血栓症(DVT)は世界的な健康上の懸念事項です。臨界閉塞の血管再カナル化を実現する第一のアプローチは、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)です。苛性副作用と CDT に関連する長い治療時間を軽減するために, アジュバントと代替アプローチが開発中です。.そのようなアプローチの1つは、気泡雲核形成を介して組織をアブラレートする集中超音波療法であるヒストトリップシーである。前臨床試験は血栓分解のためのヒストルシーと血栓溶解薬の間の強力な相乗効果を実証した。本報告書は、組織虫補助血栓溶解療法、またはリソトリップスの有効性を評価するためのベンチトップ法を概説する。

新鮮なヒト静脈血から製造された血栓は、その寸法およびアクロスメカニカル特性が腸骨静脈を模倣する流路に導入された。チャネルは、血漿およびリコンビナント組織型プラスミノーゲン活性化剤と浸透した。バブル雲は、大腿静脈血栓の治療のために設計された焦点を当てた超音波源を有する血栓に生成された。電動ポジショナーは、血栓の長さに沿ってソースフォーカスを変換するために使用されました。各インソネーション位置では、バブル雲からの音響放出を受動的に記録し、受動的キャビテーション画像を生成するためにビーム形成された。治療効果を測定するための指標には、血栓質量損失(全体的な治療効果)、およびパーフューズ動物中のD-二量体(線維化症)およびヘモグロビン(血糖化)の濃度が含まれていた。このインビトロ設計には、生体内の副作用を評価する手段の欠如や血栓のlysesとしての流量の動的変化を含む制限があります。全体として、このセットアップは、DVTを治療するためのヒストトリップシーベースの戦略の有効性を評価するための効果的な方法を提供する。

Introduction

血栓症は、循環を妨げる健康な血管における血栓形成の状態である。静脈血栓塞栓症の医療費は年間7~100億ドルで、米国では375,000-425,000例です。肺塞栓症は肺動脈の閉塞であり、静脈血栓塞栓症の最も深刻な結果である。肺閉塞の主な原因は深部静脈血栓症であり、主に腸骨静脈セグメント4、5、6からである。深部静脈血栓症(DVT)は、痛み、腫れ、足の潰瘍、および四肢切断7、8、9をもたらす長期的な合併症を有する肺閉塞以外に固有の後遺症を有する。重大な閉塞の場合、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)は、血管再カナル化10の最前線のアプローチである。CDTの結果は、血栓の年齢、場所、サイズ、組成、病因、および患者リスクカテゴリ11を含む多くの要因に依存します。さらに、CDTは、血管損傷、感染症、出血合併症、および長時間の治療時間10と関連している。次世代デバイスは、血栓溶解薬(すなわち、薬力学的血栓切れ)12,13と機械的血栓切れを組み合わせることを目指す。これらの装置の使用は、出血合併症の減少につながる薬用量を低くし、かつCDTと比較して治療時間12、13、14を短縮した。これらのデバイスは、依然として出血性の副作用や慢性血栓15の不完全な除去の問題を保持しています。したがって、より低い出血合併症で血栓を完全に除去できるアジュバント戦略が必要です。

考えられるアプローチの1つは、リソトリップシーと呼ばれるヒストトリップ補助血栓溶解治療です。ヒストトリップスは、組織16の気泡雲を核とするために焦点を当てた超音波を使用する非侵襲的な治療モダリティである。気泡活性は外因性核を介して生成されるのではなく、血栓17、18を含む組織に固有の核を活性化するのに十分な緊張を有する超音波パルスの適用によって生成される。気泡雲の機械的振動は、血栓に歪みを与え、構造を無細胞の破片19に崩壊させる。ヒストトリップスバブル活性は、インビボおよびin vitro20、21、22の両方で、引き込まれた血栓と引き込みられていない血栓の効果的な分解を提供する。以前の研究では、23,24は、組織虫と組換え組織型プラスミノーゲン活性化剤(rt-PA)の組み合わせが、単独または組織単独と比較して治療効力を有意に増加させることが実証された。ヒストトリップスバブル活性に関連する2つの主要なメカニズムが改善された治療効果の原因であると仮定される:1)改善されたリンパ球の送達による線維化症の増加、および2)血栓内の赤血球の血糖分解。血栓質量の大部分は赤血球24で構成され、したがって、赤血球分解を追跡することは、サンプルのアブレーションのための良好な代理である。他の形成された血栓要素も、ヒストトリップスバブル活性下で崩壊する可能性が高いが、このプロトコルでは考慮されない。

ここでは、リソトリップスでインビトロでDVTを治療するためのベンチトップアプローチについて概説する。プロトコルは、ヒストトリップス源の重要な動作パラメータ、治療有効性の評価、および画像ガイダンスについて説明する。このプロトコルには、腸骨静脈セグメントを模倣する流路の設計と、ヒト全血栓の製造が含まれる。実験手順は、流路に配置された血栓に沿ってヒストトリップス露光を達成するために、ヒストトリップス源およびイメージングアレイの位置を概説する。血栓破壊を達成し、オフターゲットバブル活性を最小限に抑えるための関連インソネーションパラメータが定義されている。バブル活動の誘導および評価のための超音波画像の使用は24を例示する。血塊損失、D-二量体(線維化症)、およびヘモグロビン(血化)などの治療効果を定量化するための指標は、23、24、25、26、27を概説する。全体として、この研究は、DVTを治療するためのリソトリップシーの有効性を実行し、評価するための効果的な手段を提供する。

Protocol

ここに示された結果については、静脈ヒト血液は、地元の内部審査委員会(IRB #19-1300)の承認後に血栓を形成するために引き出され、ボランティアドナー24によって提供された書面によるインフォームド・コンセントを形成した。このセクションでは、リソトリップの有効性を評価するための設計プロトコルの概要を説明します。プロトコルは、ボレンら24の?…

Representative Results

本研究で概説されているプロトコルは、DVTのインビトロセットアップにおける静脈血栓モデリング、血栓破壊のためのリソトリップ、および超音波イメージングの詳細を強調している。採用された手順は、rt-PAとヒストトリップスバブルクラウド活動の組み合わせによる血栓破壊を評価するために必要な手順を示しています。ベンチトップのセットアップは静脈の腸骨静脈の特徴を模倣する?…

Discussion

提案されたプロトコルは、リソトリップスの治療効果を定量化するモデルを提示する。重要な詳細については説明しましたが、このプロトコルの成功には、いくつかの重要な側面を考慮する必要があります。rt-PAの酵素活性は、アレニウス温度依存性30を有する。温度は水や組織の音速にも寄与する要因であり、温度の変化は焦点域の幾何学的形状のわずかな変化を引き起こ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所、グラントR01HL13334によって資金提供されました。著者らは、ドラブキンのアッセイを支援してくれたケビン・ハワース博士と、プロトコルの設計を支援してくれたヴィクトル・ボレン博士に感謝したいと考えています。著者らはまた、ヒストトリップシーソースの設計に関する彼の指導のためにアダム・マクスウェル博士に感謝しています。

Materials

Absorbing sheets Precision acoustics F28-SMALL-M 300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes Fisher Scientific 1367820A 14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes Eppendorf 22364111 1.5 mL capacity
Drabkin's assay Sigma Aldrich D5941-6VL
Draw syringe Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Filter bags McMaster-Carr 5162K111 Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing McMaster-Carr 5154K25 Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements Won Brothers HT 300 Titanium Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array Verasonics L11-5v 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose Millipore Sigma A9414
Model vessel McMaster-Carr 5234K98 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water Barnstead Nanopure Diamond ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma Vitalant 4PF000 Plasma frozen within 24 hours
Plate reader Biotek Synergy Neo HST Plate Reader For haemoglobin quantification
Probe cover Civco 610-362
Programming platform MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) Genentech Activase
Reservoir Cole-Parmer EW-07945-43 60 mL capacity
Syringe pump Cole-Parmer EW-74900-20 pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer In-house customized Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system Verasonics Vantage Research Ultrasound System
Water tank Advanced acrylics C133 14 x 14 x 12, 1/2"
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Citer Cet Article
Bhargava, A., Hendley, S. A., Bader, K. B. An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug. J. Vis. Exp. (172), e62133, doi:10.3791/62133 (2021).
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