Summary
Vi har utviklet en generalisert protokoll for å dissosiere en stor mengde høykvalitets enkeltceller fra epitelet og mesenchyme / bindevev av embryonale og voksne musetunger.
Abstract
Celledissosiasjon har vært en viktig prosedyre for studier på individcellenivå og/eller på cellepopulasjonsnivå (f.eks. enkeltcellet RNA-sekvensering og primærcellekultur). Å gi levedyktige, sunne celler i store mengder er kritisk, og de optimale forholdene for å gjøre det er vevsavhengige. Cellepopulasjoner i tungeepitelet og underliggende mesenchyme/bindevev er heterogene og vevsstrukturer varierer i forskjellige regioner og i ulike utviklingsstadier. Vi har testet protokoller for å isolere celler fra musetunge epitel og mesenchyme/bindevev i de tidlige utviklingsstadiene [embryonal dag 12,5 (E12,5)] og ung voksen (8 uker). En ren separasjon mellom epitelet og underliggende mesenchyme/bindevev var lett å oppnå. Men for å viderebehandle og isolere celler, gi levedyktige sunne celler i store mengder, og nøye utvalg av enzymatisk fordøyelsesbuffer, inkubasjonstid og sentrifugeringshastighet og tid er avgjørende. Inkubasjon av separert epitel eller underliggende mesenchyme/bindevev i 0,25% Trypsin-EDTA i 30 min ved 37 °C, etterfulgt av sentrifugering ved 200 x g i 8 minutter resulterte i et høyt utbytte av celler med høy levedyktighetsgrad (>90%) uavhengig av musestadiene og tungeområdene. Videre fant vi at både dissosierte epitelceller og mesenchymale/bindevevsceller fra embryonale og voksne tunger kunne overleve i det cellekulturbaserte mediet i minst 3 timer uten en betydelig reduksjon av celle levedyktighet. Protokollene vil være nyttige for studier som krever fremstilling av isolerte celler fra musetunger ved tidlig utvikling (E12.5) og unge voksne (8-ukers) stadier som krever celledissosiasjon fra forskjellige vevsrom.
Introduction
Pattedyrspråket er et komplekst organ som er kritisk for smak, tale og matbehandling. Den består av flere typer høyt organisert vev inndelt av mesenchyme / bindevev og dekket av et stratifisert epitelplate som inneholder smak papiller og smaksløker. Cellepopulasjoner i både tungeepitelet og mesenchyme/bindevev er heterogene. For bedre å forstå funksjonene og fordelingen av en bestemt type celler i tungen, er det nødvendig med studier ved hjelp av dissosierte celler. For eksempel er enkeltcellet RNA-sekvensering en kraftig og høy gjennomstrømningsmetode for transkripsjonsprofilering i individuelle celler, som er utformet for å forstå transkripsjonen av komplekst vev med en enkeltcellet oppløsning1,2,3,4. Primærcellekultur har vist seg å være et nyttig verktøy for å studere funksjonen og differensiering av stamceller for smaksløker5,6. Disse studiene krever en stor mengde isolerte cellepopulasjoner av høy kvalitet (f.eks. tilstrekkelig totalt cellenummer med riktig konsentrasjon og høy levedyktighet).
Dermed er det behov for å isolere celler fra forskjellige regioner i det linguale vevet og på forskjellige utviklingsstadier. For tiden er det ikke en detaljert protokoll tilgjengelig for celledissosiasjon fra tungeepitelet og underliggende mesenchyme / bindevev. Her rapporterer vi en optimalisert celledissosiasjonsmetode for å forberede celler for eksperimenter som krever høy kvalitet på levende celler som for enkeltcellet RNA-sekvensering og primære stamcellekulturer. Vi fant at valg av enzymatisk fordøyelsesbuffer, skånsom pipettering, valg av resuspensasjonsmedium og optimal sentrifugeringstid og hastighet er avgjørende for å generere disse store mengdene av celler av høy kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrebruk (C57BL/6 mus gjennom hele studien) ble godkjent av University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee og var i samsvar med National Institutes of Health Guidelines for omsorg og bruk av dyr til forskning.
1. Dyrebruk
MERK: Mus ble oppdrettet og vedlikeholdt i dyreavdelingen til dyre- og meierivitenskapsavdelingen ved University of Georgia ved 22 °C under 12-timers dag/natt sykluser.
- Angi midt på dagen for vaginal pluggdeteksjon hos mus som embryonal (E) dag 0,5. Bruk embryoer ved E12,5 og postnatale mus ved 8 ukers alder for følgende eksperimenter.
2. Forberedelse før eksperiment
MERK: Instrumentene som kreves for denne protokollen er oppført i Materiallisten.
- Autoklavinstrumenter før eksperimentet. Steriliser instrumenter ved hjelp av en perlesterilisator under eksperimentet.
- Rengjør det kirurgiske området, dissekeringsmikroskopet og biosikkerhetsskapet ved hjelp av 70% etanolservietter. Slå på UV-lyset på biosikkerhetsskapet og hold det på i 20 minutter før den eksperimentelle prosedyren.
- Forbered en enzymblanding på 1:1 dispase (5,0 mg/ml) og kollagenase (2,0 mg/ml) til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 2,5 og 1,0 mg/ml, og filtrer oppløsningen med henholdsvis 0,22 μm sprøytefilter7.
- Forbered 1 ml enzymblanding for en voksen tunge eller 0,5 ml for en bestemt tungeområde (f.eks. bakre eller fremre tunge).
- Forbered 2 ml enzymblanding for embryonale tunger.
- Lag 10 ml 2,5 % BSA i 0,1 M PBS og filtrer oppløsningen med 1 ml sprøyte og 0,22 μm sprøytefilter.
- Lag 500 μL 5% FBS i DMEM / F12.
- Lag 3 ml DMEM/F12 som inneholder 10 % FBS og 1 % BSA, og filtrer oppløsningen med 1 ml sprøyte og 0,22 μm sprøytefilter.
3. Separasjon av tungeepitelet fra mesenchyme/underliggende bindevev
- Separasjon av epitelet fra mesenchyme på en E12,5 musetunge
- Euthanize tidsbetimede gravide kvinnelige mus som bærer E12.5 embryoer ved å plassere den i et CO2-kammer etterfulgt av cervical dislokasjon.
MERK: Museembryoer på E12.5 samles inn etter kl. 12.00 (ettermiddag) den 12. - Overfør mus til det kirurgiske området. Fukt muselivet med 70% etanol for å forhindre at pels kommer inn på operasjonsstedet.
- Åpne magen ved hjelp av dissekerende saks for å eksponere livmorhornene som bærer embryoer. Disseker livmorhornene ved hjelp av dissekeringssaks og overfør den til 15 ml fersk Tyrodes løsning i en 100 mm kulturrett.
- Disseker embryoene (Figur 1A1) ut fra livmorhorn under et dissekerende mikroskop ved hjelp av minisaks og fine tang.
- Åpne munnhulen forsiktig bredt ved hjelp av fine tang og disseker tungen av fra mandibelen ved hjelp av minisaks (Figur 1A2).
- Vask tungene med 15 ml fersk steril Tyrodes oppløsning i en 100 mm kulturrett.
- Overfør vevet til 2 ml enzymblanding av dispase (2,5 mg/ml) og kollagenase (1,0 mg/ml) i en 35 mm kulturrett med spatel og fine tang i et biosikkerhetsskap. Inkuber i 20 min ved 37 °C.
- Overfør tunger til 15 ml fersk steril Tyrodes oppløsning i en 100 mm kulturrett og fjern forsiktig mesenchymet fra epitelet fra ventralsiden ved hjelp av fine tang.
MERK: Epitelplater kan separeres uten mekanisk kraft under inkubasjonen. - Vask separert epithelia og mesenchyme to ganger i 15 ml fersk steril Tyrodes oppløsning i en 100 mm kulturrett.
MERK: Aktivitetene til dispase og kollagenalus vil bli hemmet av EDTA i celledissosiasjonsprosedyren (trinn 4.1).
- Euthanize tidsbetimede gravide kvinnelige mus som bærer E12.5 embryoer ved å plassere den i et CO2-kammer etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Separasjon av tungeepitelet fra det underliggende bindevevet til voksne mus
- Avlive musen ved 8 ukers alder ved å plassere den i et CO2-kammer. Bekreft at musen er euthanized uten åndedrag og forepaw-klype respons.
- Overfør musene til det kirurgiske området. Fukt musehodet med 70% etanol for å forhindre at pels kommer inn i munnhulen.
- Klipp hjørnene av munnen langs kinnet ved hjelp av dissekering saks for å åpne munnhulen. Disseker tungen med mandibel (Figur 1B1) og legg den i en plastfat med et lag plastfolie.
- Bruk kirurgiske tang til å holde tungen under et dissekeringsmikroskop, injiser enzymblandingen av dispase (2,5 mg/ml) og kollagenase (1,0 mg/ml) i det subeptelale tungerommet gjennom skjærekanten (figur 1B1, piler) på den bakre tungen.
- Injiser 1 ml enzymblanding jevnt til hele tungen for vevsinnsamling fra både fremre og bakre tunge.
- Injiser 0,5 ml enzymblanding lokalt til den fremre tungen for vevsinnsamling fra tungespissen eller til den bakre tungen for circumvallat papillavevsinnsamling.
MERK: Tungen vil svulme etter hvert som enzymet akkumuleres (Figur 1B2). Forsiktig injeksjon av enzymet kan forhindre at trykket skader epitelet og holder så mye enzym som mulig i tungen.
- Pakk tungen med plastfolie og inkuber tungen i 30 min ved 37 °C.
- Bruk minisaks til å dissekere tungespissen og/eller circumvallate papillaen, og bruk spatel og fine tang til å overføre vev til 15 ml fersk steril Tyrodes oppløsning i en 100 mm kulturrett.
- Skill epitelet fra det underliggende bindevevet i det enzymfordøyde subepitele rommet ved hjelp av minisaks. Trim vevet til en riktig størrelse i henhold til kravet om nedstrøms eksperimenter.
- Vask det separerte epitelet og underliggende bindevev to ganger i 15 ml fersk steril Tyrodes oppløsning i en 100 mm kulturrett.
MERK: Aktivitetene til dispase og kollagenalus vil bli hemmet av EDTA i celledissosiasjonsprosedyren (trinn 4.1).
4. Celle dissosiasjon
MERK: Celledissosiasjonsprotokollen som er beskrevet her, kan brukes på tungeepitelet og mesenchyme/bindevevet i både E12,5 embryonale og 8 uker gamle mus. For å redusere celletapet under agitasjon og overføring av cellefjæring, bruk kommersielle pipettespisser med lav oppbevaring eller forhåndsbelagte pipettespisser med 2,5 % BSA i 0,1 M PBS ved pH 7,48.
- Overfør vevet ved hjelp av spatel og fine tang til 3 ml 0,25% trypsin-EDTA i en ny 35 mm kulturrett i 30 min ved 37 °C. Rør vev forsiktig hver 5 min med 1 ml pipettespisser.
MERK: Ikke klipp pipettespissen, da skjærekanten fysisk kan skade de dissosierte cellene. - Tilsett 500 μL 5% FBS i DMEM/F12 for å stoppe reaksjonen og overfør mediet til et 5 ml sentrifugerør med lav binding.
- Sentrifuger cellefjæring ved 200 x g i 8 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten.
- Re-suspendere celler forsiktig i 3 ml DMEM / F12 som inneholder 10% FBS og 1% BSA ved hjelp av 1 ml pipettespisser og filtrere cellene ved hjelp av en 70 μm cellesil, etterfulgt av en 35 μm cellesil.
- Sentrifuger celle suspensjon ved 200 x g i 8 min ved romtemperatur. Fjern det meste av mediet og la 50-300 μL være det endelige volumet for å suspendere celler på nytt.
MERK: Juster konsentrasjonen av celler i henhold til kravene til nedstrømseksperimenter ved å endre det endelige volumet av encellet suspensjon.
5. Celletelling og levedyktighetstest ved hjelp av hemocytometer
MERK: For å forbedre målenøyaktigheten anbefales 3 tekniske replikeringer for hver prøve.
- Bland forsiktig 5-10 μL av enkeltcellefjæringen med et likt volum Trypan blå og legg til hemocytometer.
MERK: Rengjør hemocytometeret grundig med 70 % etanol før bruk. Støvpartikler på hemocytometeret vil bli farget i mørkeblått og påvirke nøyaktigheten av levedyktighetstesten. Kontroller hemocytometeret under et mikroskop. - Tell det totale celletallet, antall aktive celler (hvitt) og antall døde celler (mørk blå) som er farget av Trypan blå (figur 2, piler) i 4 firkanter med 16 rutenett (figur 2) ved hjelp av invertert mikroskop med bildebehandlingssystem.
- Beregn cellekonsentrasjonen:
Cellekonsentrasjon =
- Beregn levedyktigheten:
Levedyktighet =
- Beregn levedyktigheten:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separasjon av tungeepitelet fra det underliggende mesenchyme/bindevevet
I den embryonale musetungen er et gap i subepiteringsrommet synlig etter riktig enzym fordøyelse. Epitelplater av noen tunger er skilt uten mekanisk kraft under inkubasjonen.
I den voksne musetungen er en vellykket enzyminjeksjon indikert av hevelsen i de injiserte områdene (Figur 1B2), noe som antyder at enzymet kan holdes av tungen. Utilstrekkelig enzym og/eller dyp nålinnsetting til mesenchyme og/eller tunge epitelial penetrasjon med nål vil indusere en delvis hevelse i injeksjonsområdet eller ingen hevelse i det hele tatt. Etter enzym fordøyelsen blir det underliggende bindevevet med riktig enzym fordøyelse løs og klebrig. Et gap i det subeptelale rommet er synlig når du forsiktig løfter kanten av epitelplaten.
Effekt av celledissosiasjon på totalt cellenummer og levedyktighet
Med trinn 4 ble E12,5 tunger, epitelplatene og tynne lag mesenchyme umiddelbart under epitelet av tunger samlet, henholdsvis. Manuell celletelling ved hjelp av et hemocytometer (figur 2) viste at protokollen ga totalt 63 917 celler med en levedyktighet på 95,2 % fra epitelplatene (rundt 0,3 mm2 i størrelse per tunge ) (Figur 1A3) og 294 333 celler totalt med en levedyktighet på 96,3 % fra mesenchymet (rundt 0,3 mm2 per tunge) (Figur 1A4).
Ved hjelp av 10 voksne tunger ved 8 ukers alder ble bitene av epitelplatene på tungespissen (hvor smaksløkene er tett fordelt), epitelplater av circumvallate papiller og tynne lag med bindevev umiddelbart under epitelet av circumvallate papillae samlet, henholdsvis. Et manuelt celleantall ved hjelp av hemocytometeret (figur 2) viste at protokollen ga 187 333 celler totalt med en levedyktighet på 95,4 % fra epitelplater med tungespiss (rundt 0,075 mm2 i størrelse per tunge) (Figur 1B3), 544 000 celler totalt med levedyktighet 96,3 % fra epitelplater av circumvallate papiller (ca. 0,1 mm2 i størrelse per tunge) (Figur 1B5) og 150 500 celler totalt med en levedyktighet på 93 % fra bindevev (rundt 0,1 mm2 i størrelse per tunge) (Figur 1B6).
Figur 1. Vevsforberedelse for celledissosiasjon. A) Representative bilder av et E12.5 hele embryo (A1), dorsal utsikt over den dissekerte tungen (A2), og epitelplater (A3) og mesenchyme (A4) skilt fra tunger. B) Representative bilder av en voksen tunge før (B1) og etter enzyminjeksjon (B2). Dorsal visning av et epitel ark (B3) og mesenchyme (B4) av tungespiss, og et epitel ark (B5) og underliggende bindevev (B6) av circumvallate papilla. Skalastenger: 1 mm i A1, A3, A4, B1, B2; 200 μm i A2; 100 μm i B3, B4, B5 og B6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Representative bilder av isolerte celler visualisert i hemocytometer. A) Isolerte celler fra epitelplater (A1) og mesenchyme (A2) av embryoer på E12,5. B) Isolerte celler fra epitelplater (B1) og underliggende bindevevskjerner (B2) av circumvallat papiller ved 8 ukers alder. Stiplede linjer omkranser rutenettene som forsterkes øverst til høyre. Piler peker på døde celler farget av Trypan blå. Skalastolper: 100 μm for B1,B2,B3og B4; 25 μm for bilder med høy effekt øverst til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til dags dato har det ikke vært en detaljert protokoll tilgjengelig for celledissosiasjon fra tungeepitelet og underliggende mesenchyme / bindevev. Denne gjeldende celledissosiasjonsprotokollen inneholder en reproduserbar prosedyre for å generere en enkelt cellesuspensjon med høy celle levedyktighet (>90 %) fra musetungevev, inkludert epitelplater og mesenchyme/bindevev i både embryonale og postnatale stadier, selv om isolerte celler fra E12,5 og voksne mus er forskjellige i størrelse. For eksempel er isolerte celler fra epitelet og mesenchymet av E12,5 musetunger konsistente og små i motsetning til en stor variasjon (fra liten til stor) av celler fra 8 uker gammel musetunge. Med fordelen av den høye levedyktigheten (>90%) av isolerte celler, kan den medfølgende enkeltcellesuspensjonen lette nedstrømseksperimentene som krever høy kvalitet på levedyktige celler (f.eks. enkeltcellet RNA-sekvensering og primære cellekulturer).
For å garantere den høye levedyktigheten til celler, må det tas nøye hensyn til flere viktige faktorer. En riktig fordøyelsestid med dispase og kollagenaloseblanding kan effektivt skille epitelet fra mesenchyme / underliggende bindevev samtidig som levedyktige celler bevares. En 20 min inkubasjon for embryonal tunge og en 30 min inkubasjon for voksentungen anbefales. Selv om epitelplater lett kan skrelles etter enzym fordøyelse, anbefales kutting med saks for separasjon, noe som kan bevare stamcellepopulasjonen i basalområdet av tungeepitelet9. Valget av 0,25% trypsin-EDTA over trypsin alene anbefales på det sterkeste for dissosierende celler, da 0,25% trypsin-EDTA kan dissosiere celler mer effektivt og holde celler i separasjon sammenlignet med trypsin alene. Bruk av cellekulturbasert medium (DMEM/F12 som inneholder 10 % FBS og 1 % BSA) for å suspendere celler på nytt etter enzymatisk fordøyelse er avgjørende og bidrar til høyere levedyktighet for isolerte celler sammenlignet med cellefjæringsmedium (f.eks. 1 % BSA i 0,1 M PBS). I tillegg har isolerte celler en høyere overlevelsesrate i dette mediet over tid: minst 3 timer uten betydelig reduksjon av celle levedyktighet. Pipetteringsteknikken er en annen kritisk faktor for å sikre høy celle levedyktighet. Forsiktig aspirering av de supernatante og re-suspenderende cellene ved hjelp av en pipette kan redusere ekstra celletap og fysisk skade på celler.
Konsentrasjonen av isolerte celler i en enkelt celle suspensjon er en annen viktig vurdering for nedstrøms eksperimenter. I et totalt gitt cellenummer kan cellekonsentrasjonen justeres basert på det endelige volumet av resuspendert løsning. For den første studien når totalt cellenummer er ukjent, bør resuspension av isolerte celler starte med lavt volum. Deretter kan isolerte celler fortynnes basert på kravene til nedstrøms eksperimenter. Vær oppmerksom på at i vår kulturmediumbaserte løsning ble det funnet cellulære aggregater da konsentrasjonen var høyere enn 4000 celler / μL (rundt 200 celler per kvadrat i hemocytometer). De optimale konsentrasjonene varierer fra 500 til 2500 celler / μL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01DC012308 og R21DC018089 til HXL. Vi takker Brett Marshall (University of Georgia, Athen, GA) og Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) for teknisk assistanse og konsultasjon angående celledissosiasjon; til Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athen, GA) for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. Tissue Morphogenesis. , Springer. 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
