In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels
Summary
Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.
Abstract
In de afgelopen tien jaar heeft de vooruitgang in genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GESI’s) een revolutie in in vivo functionele beeldvorming bevorderd. Met behulp van calcium als een proxy voor neuronale activiteit, bieden deze technieken een manier om de reacties van individuele cellen binnen grote neuronale ensembles op een verscheidenheid aan stimuli in realtime te volgen. Wij, en anderen, hebben deze technieken toegepast om de reacties van individuele geniculate ganglionneuronen op smaakprikkels toegepast op de tongen van levende verdoofde muizen in beeld te brengen. Het geniculate ganglion bestaat uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren, evenals enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren. Het in beeld brengen van de smaak-opgeroepen reacties van individuele geniculate ganglion neuronen met GCaMP heeft belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen, evenals een manier om perifere smaak misdrainende fenotypes in genetisch gemanipuleerde muizen te detecteren. Hier demonstreren we de chirurgische procedure om het geniculate ganglion bloot te leggen, GCaMP fluorescentiebeeldacquisitie, eerste stappen voor gegevensanalyse en probleemoplossing. Deze techniek kan worden gebruikt met transgeen gecodeerde GCaMP of met AAV-gemedieerde GCaMP-expressie en kan worden gewijzigd om bepaalde genetische subsets van belang in beeld te brengen (d.w.z. Cre-gemedieerde GCaMP-expressie). Over het algemeen is in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglionneuronen een krachtige techniek voor het monitoren van de activiteit van perifere smaakneuronen en biedt het aanvullende informatie aan meer traditionele chorda tympani-opnames van de hele zenuw of smaakgedragstests.
Introduction
Een belangrijk onderdeel van het perifere smaaksysteem van zoogdieren is het geniculate ganglion. Naast enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren, bestaat het geniculate uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren. Net als andere perifere sensorische neuronen zijn de geniculate ganglionneuronen pseudo-unipolair met een lang axon dat perifeer projecteert naar de smaakpapillen en centraal naar de hersenstamkern van het solitaire kanaal1. Deze neuronen worden voornamelijk geactiveerd door de afgifte van ATP door smaakreceptorcellen die reageren op smaakprikkels in de mondholte2,3. ATP is een essentiële neurotransmitter voor smaaksignalering en P2rx-receptoren uitgedrukt door de smaakganglionneuronen zijn nodig voor hun activering4. Gezien het feit dat smaakreceptorcellen specifieke smaakreceptoren uitdrukken voor een bepaalde smaakmodaliteit (zoet, bitter, zout, umami of zuur), is verondersteld dat smaakganglionneuronreacties op smaakprikkels ook nauw afgestemd zouden zijn5.
Hele zenuwopnamen hebben aangetoond dat zowel de chorda tympani als de grotere superieure petrosale zenuwen smaaksignalen geleiden die alle vijf smaakmodaliteiten vertegenwoordigen voor het geniculate ganglion6,7. Dit liet echter nog steeds vragen over de specificiteit van neuronale reacties op een bepaalde smaakstof: als er smaakmodaliteitsspecifieke neuronen, polymodale neuronen of een mengsel van beide zijn. Enkelvoudige vezelopnamen geven meer informatie over de activiteit van individuele vezels en hun chemische gevoeligheden8,9,10,maar deze methodologie is beperkt tot het verzamelen van gegevens van kleine aantallen vezels. Evenzo geven in vivo elektrofysiologische opnames van individuele ratgeniculate ganglionneuronen informatie over de reacties van individuele neuronen11,12,13, maar verliezen nog steeds de activiteit van de populatie en leveren relatief weinig neuronregistraties per dier op. Om de responspatronen van neuronale ensembles te analyseren zonder de activiteit van individuele neuronen uit het oog te verliezen, moesten nieuwe technieken worden gebruikt.
Calciumbeeldvorming, vooral met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren zoals GCaMP, heeft deze technische doorbraakopgeleverd 14,15,16,17,18. GCaMP gebruikt calcium als een proxy voor neuronale activiteit, waardoor groene fluorescentie toeneemt naarmate het calciumgehalte in de cel stijgt. Nieuwe vormen van GCaMP worden nog steeds ontwikkeld om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de bindingskinetiek aan te passen en aan te passen voor gespecialiseerde experimenten19. GCaMP biedt resolutie van één neuron, in tegenstelling tot hele zenuwopname, en kan tegelijkertijd reacties van ensembles van neuronen meten, in tegenstelling tot enkelvoudige vezel- of enkele celregistratie. Calciumbeeldvorming van de geniculate ganglia heeft al belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen16,20, en heeft perifere smaakmisdrading fenotypes geïdentificeerd in genetisch gemanipuleerde muizen18.
Een grote moeilijkheid bij het toepassen van in vivo calciumbeeldvormingstechnieken op het geniculate ganglion is dat het is ingekapseld in de benige trommelvliesbula. Om optische toegang tot het geniculate te verkrijgen, is delicate chirurgie vereist om de lagen botten te verwijderen, terwijl het ganglion intact blijft. Voor dat doel hebben we deze gids gemaakt om andere onderzoekers te helpen toegang te krijgen tot het geniculate ganglion en de GCaMP-gemedieerde fluorescerende reacties van deze neuronen op smaakstimuli in vivo in beeld te brengen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft een stapsgewijs protocol om het geniculate ganglion operatief bloot te leggen en de activiteit van zijn neuronen visueel vast te leggen met GCaMP6s. Deze procedure lijkt erg op die eerder beschreven17, met een paar opmerkelijke uitzonderingen. Ten eerste zorgt het gebruik van een hoofdpost voor een eenvoudige aanpassing van de hoofdpositie tijdens de operatie. Ten tweede, met betrekking tot stimulusafgifte, stroomt de aanpak van Wu en Dvoryanchikov smaakprikkels door slokdarmbu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken S. Humayun voor de muizenhouderij. Financiering voor dit werk is gedeeltelijk verstrekt door UTSA’s Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) en NIH-SC2-GM130411 aan L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neurosciences. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
