Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto
Summary
Aquí presentamos cómo exponer el ganglio geniculado de un ratón de laboratorio vivo y anestesiado y cómo usar imágenes de calcio para medir las respuestas de conjuntos de estas neuronas a los estímulos del sabor, lo que permite múltiples ensayos con diferentes estimulantes. Esto permite comparaciones en profundidad de qué neuronas responden a qué saborantes.
Abstract
En los últimos diez años, los avances en los indicadores de calcio codificado genéticamente (GECI) han promovido una revolución en la imagen funcional in vivo. Utilizando el calcio como un sustituto de la actividad neuronal, estas técnicas proporcionan una forma de monitorear las respuestas de las células individuales dentro de grandes conjuntos neuronales a una variedad de estímulos en tiempo real. Nosotros, y otros, hemos aplicado estas técnicas para obtener imágenes de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas individuales a los estímulos de sabor aplicados a las lenguas de ratones anestesiados vivos. El ganglio geniculado está compuesto por los cuerpos celulares de las neuronas gustativas que inervan la lengua y el paladar anteriores, así como algunas neuronas somatosensoriales que inervan el pabellón auricular del oído. La obtención de imágenes de las respuestas evocadas por el gusto de las neuronas ganglionares geniculadas individuales con GCaMP ha proporcionado información importante sobre los perfiles de sintonía de estas neuronas en ratones de tipo salvaje, así como una forma de detectar fenotipos periféricos de mal cableado del gusto en ratones manipulados genéticamente. Aquí demostramos el procedimiento quirúrgico para exponer el ganglio geniculado, la adquisición de imágenes de fluorescencia GCaMP, los pasos iniciales para el análisis de datos y la solución de problemas. Esta técnica se puede utilizar con GCaMP codificado transgénicamente, o con expresión GCaMP mediada por AAV, y se puede modificar para obtener imágenes de subconjuntos genéticos particulares de interés (es decir, expresión GCaMP mediada por Cre). En general, las imágenes de calcio in vivo de las neuronas ganglionares geniculadas son una técnica poderosa para monitorear la actividad de las neuronas gustativas periféricas y proporcionan información complementaria a las grabaciones más tradicionales de la cuerda del nervio entero tympani o los ensayos de comportamiento del gusto.
Introduction
Un componente clave del sistema de sabor periférico de los mamíferos es el ganglio geniculado. Además de algunas neuronas somatosensoriales que inervan el pabellón auricular del oído, el geniculado está compuesto por los cuerpos celulares de las neuronas gustativas que inervan la lengua y el paladar anteriores. Al igual que otras neuronas sensoriales periféricas, las neuronas ganglionares geniculadas son pseudo-unipolares con un axón largo que se proyecta periféricamente a las papilas gustativas, y centralmente al núcleo del tronco encefálico del tracto solitario1. Estas neuronas se activan principalmente por la liberación de ATP por las células receptoras del gusto que responden a los estímulos gustales en la cavidad oral2,3. El ATP es un neurotransmisor esencial para la señalización del gusto, y los receptores P2rx expresados por las neuronas ganglionares gustativas son necesarios para su activación4. Dado que las células receptoras del gusto expresan receptores de sabor específicos para una modalidad de sabor particular (dulce, amargo, salado, umami o agrio), se ha planteado la hipótesis de que las respuestas de las neuronas ganglionares gustativas a los estímulos gustativos también estarían estrechamente sintonizadas5.
Las grabaciones de nervios enteros han demostrado que tanto la cuerda tímpano como los nervios petrosales superiores mayores conducen señales gustativas que representan las cinco modalidades de sabor al ganglio geniculado6,7. Sin embargo, esto todavía dejaba preguntas sobre la especificidad de las respuestas neuronales a un sabor dado: si hay neuronas específicas de la modalidad del gusto, neuronas polimodales o una mezcla de ambas. Los registros de fibra única dan más información sobre la actividad de las fibras individuales y sus sensibilidades químicas8,9,10,pero esta metodología se limita a recopilar datos de un pequeño número de fibras. Del mismo modo, los registros electrofisiológicos in vivo de neuronas ganglionares geniculadas de ratas individuales dan información sobre las respuestas de neuronas individuales11,12,13, pero aún pierden la actividad de la población y producen relativamente pocos registros de neuronas por animal. Para analizar los patrones de respuesta de los conjuntos neuronales sin perder de vista la actividad de las neuronas individuales, fue necesario emplear nuevas técnicas.
Las imágenes de calcio, especialmente utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente como GCaMP, han proporcionado este avance técnico14,15,16,17,18. GCaMP utiliza el calcio como un sustituto de la actividad neuronal, aumentando la fluorescencia verde a medida que aumentan los niveles de calcio dentro de la célula. Se siguen desarrollando nuevas formas de GCaMP para mejorar la relación señal/ruido, ajustar la cinética de unión y adaptarse a experimentos especializados19. GCaMP proporciona resolución de una sola neurona, a diferencia de la grabación de todo el nervio, y puede medir simultáneamente las respuestas de conjuntos de neuronas, a diferencia de la grabación de una sola fibra o de una sola célula. Las imágenes de calcio de los ganglios geniculados ya han proporcionado información importante sobre los perfiles de sintonía de estas neuronas en ratones de tipo salvaje16,20, y ha identificado fenotipos de mal cableado de sabor periférico en ratones manipulados genéticamente18.
Una dificultad importante para aplicar técnicas de imagen de calcio in vivo al ganglio geniculado es que está encapsulado dentro de la bulla timpánica ósea. Para obtener acceso óptico al geniculado, se requiere una cirugía delicada para eliminar las capas de huesos, manteniendo el ganglio intacto. Para ello, hemos creado esta guía para ayudar a otros investigadores a acceder al ganglio geniculado e imaginar las respuestas fluorescentes mediadas por GCaMP de estas neuronas para saborear estímulos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe un protocolo paso a paso para exponer quirúrgicamente el ganglio geniculado y registrar visualmente la actividad de sus neuronas con GCaMP6s. Este procedimiento es muy similar al descrito anteriormente17,con algunas excepciones notables. En primer lugar, el uso de un poste de la cabeza permite un fácil ajuste de la posición de la cabeza durante la cirugía. En segundo lugar, con respecto a la entrega de estímulos, el enfoque de Wu y Dvoryanchikov hace fluye los estímulos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a S. Humayun por la cría de ratones. El financiamiento para este trabajo ha sido proporcionado en parte por el Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) de UTSA y NIH-SC2-GM130411 a L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
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