Estimation des nanocristaux urinaires chez l’homme à l’aide de l’étiquetage des fluorophores de calcium et de l’analyse de suivi des nanoparticules
Summary
L’objectif de cette étude était de déterminer si l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pouvait détecter et quantifier les nanocristaux urinaires contenant du calcium provenant d’adultes en bonne santé. Les résultats de la présente étude suggèrent que le NTA pourrait être un outil potentiel pour estimer les nanocristaux urinaires pendant la maladie des calculs rénaux.
Abstract
Les calculs rénaux sont de plus en plus répandus dans le monde entier chez les adultes et les enfants. Le type le plus commun de calcul rénal est composé de cristaux d’oxalate de calcium (CaOx). La cristallurie survient lorsque l’urine devient sursaturée avec des minéraux (p. ex. calcium, oxalate, phosphate) et précède la formation de calculs rénaux. Les méthodes standard pour évaluer la cristallurie dans les formeurs de pierre incluent la microscopie, la filtration, et la centrifugation. Cependant, ces méthodes détectent principalement les microcristaux et non les nanocristaux. Les nanocristaux ont été suggérés comme plus nocifs pour les cellules épithéliales rénales que les microcristaux in vitro. Ici, nous décrivons la capacité de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) à détecter les nanocristaux urinaires humains. Des adultes en bonne santé ont été alimentés un régime contrôlé d’oxalate avant de boire une charge d’oxalate pour stimuler des nanocristaux urinaires. L’urine a été rassemblée pendant 24 heures avant et après la charge d’oxalate. Les échantillons ont été traités et lavés à l’éthanol pour purifier les échantillons. Des nanocristaux urinaires ont été souillés avec le fluorophore de liaison de calcium, Fluo-4 AM. Après coloration, la taille et le nombre de nanocristaux ont été déterminés à l’aide de NTA. Les résultats de cette étude montrent que le NTA peut détecter efficacement la nanocristallurie chez les adultes en bonne santé. Ces résultats suggèrent que le NTA pourrait être une méthode de détection précoce valable de nanocristalluria dans les patients présentant la maladie de calcul rénal.
Introduction
Les cristaux urinaires se forment lorsque l’urine devient sursaturée de minéraux. Cela peut se produire chez les personnes en bonne santé, mais est plus fréquent chez les personnes atteintes de calculs rénaux1. La présence et l’accumulation de cristaux urinaires peuvent augmenter le risque de développer un calcul rénal. Plus précisément, cela se produit lorsque les cristaux se lient à la plaque de Randall, se nucléent, s’accumulent et se développent au fil du temps2,3,4. La cristallurie précède la formation de calculs rénaux et l’évaluation de la cristallurie peut avoir une valeur prédictive dans les calculs rénaux3,5. Spécifiquement, le crystalluria a été suggéré pour être utile pour prévoir le risque de répétition de pierre dans les patients présentant une histoire d’oxalate de calcium contenant des pierres6,7.
Il a été rapporté que les cristaux ont un impact négatif sur la fonction épithéliale rénale et circulante des cellules immunitaires8,9,10, 11,12,13. On l’a précédemment rapporté que les monocytes de circulation de l’oxalate de calcium (CaOx) les formers de calcul rénal ont supprimé la bioénergétique cellulaire comparée aux individus en bonne santé14. De plus, les cristaux de CaOx réduisent la bioénergétique cellulaire et perturbent l’homéostasie redox dans les monocytes8. La consommation de repas riches en oxalate peut provoquer une cristallurie qui pourrait entraîner des dommages aux tubules rénaux et altérer la production et la fonction des macromolécules urinaires qui protègent contre la formation de calculs rénaux15,16. Plusieurs études ont démontré que les cristaux urinaires peuvent varier en forme et en taille en fonction du pH et de la température de l’urine17,18,19. De plus, il a été démontré que les protéines urinaires modulent le comportement cristallin20. Daudon et coll.19, ont proposé que l’analyse de la cristallurie pourrait être utile dans la prise en charge des patients atteints de maladie des calculs rénaux et dans l’évaluation de leur réponse aux thérapies. Quelques méthodes classiques actuellement disponibles pour évaluer la présence de cristaux comprennent la microscopie polarisée21,22,la microscopie électronique23,les compteurs de particules3,la filtration d’urine24,l’évaporation3,5 ou la centrifugation21. Ces études ont fourni la perspicacité valable au champ de calcul rénal concernant le crystalluria. Cependant, une limitation de ces méthodes a été l’incapacité de visualiser et de quantifier les cristaux de moins de 1 μm. Des cristaux de cette taille peuvent influencer la croissance des pierres de CaOx en se fixant à la plaque de Randall.
Il a été démontré que les nanocristaux causent des lésions importantes aux cellules rénales par rapport aux microcristaux plus grands25. La présence de nanocristaux a été signalée dans l’urine à l’aide d’un analyseur de nanoparticules26,27. Des études récentes ont utilisé des sondes bisphosphate marqués par fluorescence (alendronate-fluorescéine/alendronate-Cy5) pour examiner des nanocristaux à l’aide de la cytométrie en flux à l’échelle nanométrique28. La limitation de ce colorant est qu’il n’est pas spécifique et se liera à presque tous les types de calculs à l’exception de la cystéine. Ainsi, évaluer avec précision la présence de nanocristaux chez les individus peut être un outil efficace pour diagnostiquer la cristallurie et/ou prédire le risque de pierre. Le but de cette étude était de détecter et de quantifier les nanocristaux contenant du calcium (<1 μm) à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Pour ce faire, la technologie NTA a été utilisée en combinaison avec un fluorophore liant le calcium, Fluo-4 AM pour détecter et quantifier les nanocristaux contenant du calcium dans l’urine d’adultes en bonne santé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le NTA a été utilisé dans la présente étude pour évaluer les nanocristaux dans l’urine humaine à l’aide d’une sonde de liaison au calcium, Fluo-4 AM. Il n’existe pas de méthode standard pour détecter les nanocristaux dans l’urine. Certains groupes de recherche ont détecté des nanocristaux dans l’urine et se sont appuyés sur l’utilisation de protocoles ou de méthodes étendus qui sont limités dans leur capacité à quantifier les échantillons27,<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient tous les participants à l’étude ainsi que le centre de bionutrition et le centre de services d’imagerie haute résolution de l’UAB CCTS pour leurs contributions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH DK106284 et DK123542 (TM), et UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
References
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall’s plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
- Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
- Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
- Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone “activity”. British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
- Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
- Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
- Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
- Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
- Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
- Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
- Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
- Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
- Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
- Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
- Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
- Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
- Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
- Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, 624-632 (2016).
- Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
- Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
- Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. . Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , 261-263 (2001).
- Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
- Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
- Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250 (2017).
- He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
- Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9 (2014).
- Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328 (2016).
- Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
- Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research–A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45 (2009).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
- Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
- Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101 (2013).
- Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson’s disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).
