칼슘 플루오로포어 라벨링 및 나노입자 추적 분석을 사용하여 인간에서 오줌 나노 결정의 추정
Summary
이 연구의 목적은 나노 입자 추적 분석 (NTA)이 건강한 성인의 나노 결정을 포함하는 오줌 칼슘을 감지하고 정량화 할 수 있는지 여부를 결정하는 것이었습니다. 현재 연구 결과에서 사실 인정은 NTA가 신장 결석 질병 도중 오줌 나노 결정을 추정하는 잠재적인 공구일 수 있었다는 것을 건의합니다.
Abstract
신장 결석은 성인과 아이들에서 전 세계적으로 더 널리 퍼지고 있습니다. 신장 결석의 일반적인 모형은 칼슘 옥살레이트 (CaOx) 결정의 구성됩니다. 결정루리아는 소변이 미네랄(예: 칼슘, 옥살레이트, 인산염)으로 과포화되고 신장 결석 형성에 선행될 때 발생합니다. 돌 전자에서 결정루리아를 평가하는 표준 방법은 현미경 검사법, 여과 및 원심 분리를 포함한다. 그러나, 이 방법은 주로 나노 결정이 아닌 마이크로 결정을 검출합니다. 나노 결정은 시험관내 미세 결정보다는 신장 상피 세포에 더 유해하도록 제안되었습니다. 여기서는 나노입자 추적 분석(NTA)이 인간의 오줌 나노 결정을 검출하는 능력을 설명합니다. 건강한 성인은 오줌 나노 결정을 자극하기 위해 옥살레이트 부하를 마시기 전에 통제 된 옥살레이트 식단을 공급받았습니다. 소변은 옥살레이트 하중 전후 24시간 동안 수거되었다. 샘플을 가공하여 에탄올로 세척하여 샘플을 정화했습니다. 요로 나노 결정은 칼슘 결합 형광소, 플루오-4 오전로 염색되었다. 염색 후, 나노 결정의 크기와 수는 NTA를 사용하여 결정되었다. 이 연구 결과에서 사실 인정은 NTA가 건강한 성인에 있는 나노 결정루아를 능통하게 검출할 수 있었다는 것을 보여줍니다. 이 사실 인정은 NTA가 신장 결석 질병을 가진 환자에 있는 나노 결정루리아의 귀중한 조기 탐지 방법일 수 있었다는 것을 건의합니다.
Introduction
소변 결정은 소변이 미네랄로 과포화될 때 형성됩니다. 이것은 건강한 개별에서 생길 수 있습니다 그러나 신장 결석을 가진 개별에서 일반적 입니다1. 오줌 결정의 존재와 축적은 신장 결석을 개발의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 구체적으로, 이것은 결정이 랜달의 플라크에 결합할 때, 핵, 축적, 그리고 시간이지남에따라2,3,4증가할 때 생깁니다. 결정루리아는 신장 결석 형성 및 결정성루리아의 평가를 선행하여 신장 결석 전자3,5에서예측값을 가질 수 있다. 구체적으로, 결정루리아는 돌6,7을함유하는 칼슘 산화칼슘의 역사를 가진 환자에서 돌 재발의 위험을 예측하는 데 유용할 것으로 제안되고 있다.
결정은 신장 상피 및 순환 면역 세포 기능8,9,10,11,12,13에부정적인 영향을 보고되었다. 이전에는 칼슘 옥살레이트(CaOx) 신장 결석 전자로부터 단핵구를 순환시키는 것이 건강한 개인에 비해 세포 생체 정력을 억제한 것으로 보고되었다14. 또한, CaOx 결정은 세포 생체 에너지를 감소시키고 단핵구8에서레독스 항상성을 방해한다. 옥살레이트가 풍부한 식사의 소비는 신장 관 손상으로 이어질 수 있는 결정루리아를 유발하고 신장 결석 형성에 대한 보호되는 오줌 거대 분자의 생산 및 기능을 변경할 수 있다15,16. 여러 연구는 소변 결정이 소변 의 pH 및 온도에 따라 모양과 크기가 다를 수 있음을입증했다 17,18,19. 또한, 오줌 단백질은 결정거동(20)을조절하는 것으로 나타났다. Daudon외. 19,결정성 루리아 분석은 신장 결석 질병을 가진 환자의 관리에 도움이 될 수 있고 치료에 그들의 반응을 평가하는 데 도움이 될 수 있다는 것을 건의했습니다. 현재 결정의 존재를 평가하기 위해 사용할 수 있는 몇 가지 통상적인 방법은 편광 현미경검사법(21,22,전자 현미경검사법 23,입자 카운터3,소변 여과24,증발3,5 또는 원심분리21)을포함한다. 이 연구 결과는 결정루리아에 관하여 신장 결석 필드에 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이러한 방법의 한계는 크기가 1 μm 미만인 결정을 시각화하고 정량화할 수 없다는 것입니다. 이 크기의 결정은 랜달의 플라크에 부착하여 CaOx 돌의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다.
나노 결정은 더 큰 미세 결정(25)에비해 신장 세포에 광범위한 부상을 일으키는 것으로 나타났습니다. 나노결정의 존재는 나노입자분석기(26,27)를이용하여 소변에서 보고되었다. 최근 연구는 형광으로 표지된 비스포스페이트 프로브(alendronate-fluorescein/alendronate-Cy5)를 사용하여 나노스케일 유동세포측정제(28)를사용하여 나노결정을 검사하였다. 이 염료의 한계는 구체적이지 않으며 시스테인을 제외한 거의 모든 종류의 돌에 결합한다는 것입니다. 따라서, 개별에 있는 나노결정의 존재를 정확하게 평가하는 것은 결정루리아를 진단하고 돌 리스크를 예측하는 효과적인 공구일 수 있습니다. 이 연구의 목적은 나노 입자 추적 분석 (NTA)을 사용하여 나노 결정 (<1 μm 크기)을 포함하는 칼슘을 검출하고 정량화하는 것이었습니다. 이를 달성하기 위해 NTA 기술은 건강한 성인의 소변에 나노 결정을 함유한 칼슘을 검출하고 정량화하기 위해 오전 플루오-4 칼슘 결합 형광소와 병용하여 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTA는 칼슘 결합 프로브, Fluo-4 AM을 사용하여 인간의 소변에 있는 나노 결정을 평가하기 위하여 본 연구 결과에서 이용되었습니다. 소변에서 나노 결정을 검출하는 데 사용할 수있는 표준 방법은 없습니다. 일부 연구 그룹은 소변에서 나노 결정을 검출하고 샘플27,28을정량화하는 능력에 제한된 광범위한 프로토콜 또는 방법의 사용에 의존했다. 이 연구는…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 모든 연구 참가자와 UAB CCTS 바이오 영양 코어 및 UAB 고해상도 이미징 서비스 센터에서 기여에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 DK106284 및 DK123542 (TM), UL1TR003096 (국립 번역 과학 센터)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
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