Isolatie en kweek van residente cardiale macrofagen van de Murine Sinoatriale en Atrioventriculaire Knoop
Summary
Het hier gepresenteerde protocol biedt een stapsgewijze aanpak voor de isolatie van cardiale residente macrofagen uit het sinoatriale knooppunt (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) gebied van muizenharten.
Abstract
Van residente cardiale macrofagen is aangetoond dat ze de elektrische geleiding in het hart vergemakkelijken. Het fysiologische hartritme wordt geïnitieerd door elektrische impulsen gegenereerd in sinoatriale knoop (SAN) en vervolgens geleid naar ventrikels via atrioventriculaire knoop (AVN). Om de rol van residente macrofagen in het hartgeleidingssysteem verder te bestuderen, is een goede isolatie van residente macrofagen van SAN en AVN noodzakelijk, maar het blijft een uitdaging. Hier bieden we een protocol voor de betrouwbare microdissectie van de SAN en AVN in muizenharten, gevolgd door de isolatie en cultuur van residente macrofagen.
Zowel SAN, dat zich op de kruising van de crista terminalis met de superieure vena cava bevindt, als AVN dat zich op de top van de driehoek van Koch bevindt, worden geïdentificeerd en gemicrodisseceerd. De juiste locatie wordt bevestigd door histologische analyse van het weefsel uitgevoerd met Masson’s trichrome kleuring en door anti-HCN4.
Microdissected weefsels worden vervolgens enzymatisch verteerd om eencellige suspensies te verkrijgen, gevolgd door de incubatie met een specifiek panel van antilichamen gericht tegen celtypespecifieke oppervlaktemarkers. Dit maakt het mogelijk om verschillende celpopulaties te identificeren, te tellen of te isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering. Om cardiale residente macrofagen te onderscheiden van andere immuuncellen in het myocardium, met name gerekruteerde van monocyten afgeleide macrofagen, is een delicate bedachte gatingstrategie nodig. Ten eerste worden lymfoïde afstammingscellen gedetecteerd en uitgesloten van verdere analyse. Vervolgens worden myeloïde cellen geïdentificeerd met residente macrofagen die worden bepaald door hoge expressie van zowel CD45 als CD11b en lage expressie van Ly6C. Met celsortering kunnen geïsoleerde hartmacrofagen vervolgens gedurende meerdere dagen in vitro worden gekweekt voor verder onderzoek. We beschrijven daarom een protocol om cardiale residente macrofagen te isoleren die zich in het hartgeleidingssysteem bevinden. We bespreken valkuilen bij het microdissecteren en verteren van SAN en AVN, en bieden een gating-strategie om cardiale macrofagen betrouwbaar te identificeren, tellen en sorteren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.
Introduction
De sinoatriale knoop (SAN) initieert fysiologisch de elektrische impuls en is daarom de primaire pacemaker van het hart. De atrioventriculaire knoop (AVN) geleidt de elektrische impuls van de boezems naar de ventrikels en fungeert ook als een secundaire pacemaker1. Over het algemeen is het genereren en geleiden van elektrische impulsen een complex proces dat kan worden gemoduleerd door verschillende factoren2, waaronder residente macrofaag in SAN / AVN-regio’s. Een recente studie van Hulsmans et al. toont een specifieke populatie van cardiale macrofagen die verrijkt zijn in de AVN en functioneren als belangrijke spelers bij het houden van een stabiele hartslag3. Ze ontdekten dat macrofagen elektrisch gekoppeld zijn aan de cardiomyocyten en de elektrische eigenschappen van gekoppelde cardiomyocyten kunnen veranderen. De auteurs merken ook op dat dergelijke geleidende cellen die interleaving met macrofagen ook aanwezig zijn in andere componenten van het hartgeleidingssysteem, zoals het SAN.
Momenteel is het niet volledig bekend of het fenotype van residente cardiale macrofagen verschilt tussen de hartregio’s. Het is echter aangetoond dat de weefselmicro-omgeving de transcriptie en proliferatieve vernieuwing van weefselmacrofagen kan beïnvloeden4. Aangezien is aangetoond dat het fenotype van cardiomyocyten verschilt tussen regio’s, kunnen de functionele effecten van macrofagen op cardiomyocyten ook regiospecifiek zijn, zelfs als het macrofaagfenotype zelf hetzelfde kan zijn. Daarom zijn verdere studies over specifieke hartregio’s nodig.
Recente studies hebben aangetoond dat, in steady state, de weefselresidente macrofagen prenataal worden vastgesteld, onafhankelijk van definitieve hematopoëse ontstaan en aanhouden tot in de volwassenheid5. Echter, na macrofaag uitputting of tijdens hartontsteking, Ly6chi monocyten bijdragen aan het aanvullen van cardiale macrofaag populatie6. Studies met betrekking tot genetische afstammingstracering, parabiose, lotkartering en celtracking toonden de coëxistentie aan van een verscheidenheid aan weefselresidente macrofagenpopulaties in organen en weefsels, en ook verschillend cellulair gedrag van macrofaagsubsets die mogelijk geassocieerd zijn met hun ontogenie 7,8,9.
Karakterisering van residente cardiale macrofagen heeft geprofiteerd van het gebruik van magnetische geactiveerde celsortering (MACS) en fluorescente geactiveerde celsortering. Deze methoden zijn vooral nuttig voor het isoleren van specifieke celpopulaties van meerdere weefselfracties door ze te labelen met hun celoppervlakmarkers. Dit leidt niet alleen tot een hogere zuiverheid van het geïsoleerde immuunceltype, maar maakt ook fenotypische analyse mogelijk. Hier presenteren we een protocol met magnetische kralen-gecoate cellen gevolgd door fluorescente geactiveerde celsortering voor de verrijking van cardiale residente macrofagen die specifiek geïsoleerd zijn uit het SAN- en AVN-gebied.
Om de kenmerken van cardiale macrofagen in het geleidingssysteem en hun functie voor hartgeleiding en aritmogenese te onderzoeken, zijn nauwkeurige lokalisatie en dissectie van SAN en AVN van cruciaal belang. Voor microdissectie van SAN en AVN worden anatomische oriëntatiepunten gebruikt voor de regio-identificatie10. Kortom, SAN bevindt zich op de kruising van de superieure vena cava en het rechter atrium. AVN bevindt zich binnen de driehoek van Koch, die vooraan wordt begrensd door de septumfolder van de tricuspidalisklep en achteraan door de pees van Todaro11. We bieden ook een nauwkeurige microdissectieprocedure van SAN en AVN bij muizen, die wordt bevestigd door histologie en immunofluorescentiekleuring.
Geïsoleerde residente macrofagen kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten zoals RNA-sequencing of kunnen worden hersteld en gedurende meer dan twee weken worden gekweekt, waardoor verschillende in vitro experimenten mogelijk zijn. Daarom beschrijft ons protocol een zeer waardevolle procedure voor de immunoritmoloog. Tabel 1 toont de samenstelling van alle benodigde oplossingen, figuur 1 toont de microdissectie-oriëntatiepunten voor SAN en AVN. Figuur 2 is een schematische illustratie van SAN- en AVN-lokalisatie. Figuur 3 toont de histologische kleuring van SAN en AVN (Masson’s trichrome en immunofluorescentiekleuring). Figuur 4 toont een stapsgewijze gatingstrategie om cardiale residente macrofagen te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de verrijking van cardiale macrofagen specifiek uit de SAN- en AVN-regio’s met een hoge zuiverheidsgraad.
Macrofagen zijn onderverdeeld in subpopulaties op basis van hun anatomische locatie en functioneel fenotype. Ze kunnen ook overschakelen van het ene functionele fenotype naar het andere als reactie op variabele micro-omgevingssignalen13. In vergelijking met andere organen zoals beenmerg en lever bevat hartweefsel ee…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de China Scholarship Council (CSC, aan R. Xia), het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255 aan S. Clauss, 81Z0600206 aan S. Kääb, 81Z0600204 aan C.S.), de Corona Foundation (S199/10079/2019 aan S. Clauss), de SFB 914 (project Z01 aan S. Massberg), het ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 aan S. Clauss) en de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (aan S. Clauss). De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
