Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino
Summary
O protocolo aqui apresentado fornece uma abordagem passo-a-passo para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos da região do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) de corações de camundongos.
Abstract
Macrófagos cardíacos residentes demonstraram facilitar a condução elétrica no coração. O ritmo cardíaco fisiológico é iniciado por impulsos elétricos gerados no nó sinoatrial (SAN) e, em seguida, conduzidos aos ventrículos via nó atrioventricular (AVN). Para estudar melhor o papel dos macrófagos residentes no sistema de condução cardíaca, é necessário um isolamento adequado dos macrófagos residentes da SAN e da AVN, mas continua sendo um desafio. Aqui, fornecemos um protocolo para a microdissecção confiável da SAN e AVN em corações murinos seguida pelo isolamento e cultura de macrófagos residentes.
Tanto a SAN, que está localizada na junção da crista terminalis com a veia cava superior, quanto a AVN, que está localizada no ápice do triângulo de Koch, são identificadas e microdissecadas. A localização correta é confirmada pela análise histológica do tecido realizada com a coloração tricrômica de Masson e pelo anti-HCN4.
Os tecidos microdissecados são então digeridos enzimaticamente para obter suspensões unicelulares seguidas pela incubação com um painel específico de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície específicos do tipo celular. Isso permite identificar, contar ou isolar diferentes populações de células por classificação de células ativadas fluorescentes. Para diferenciar macrófagos residentes cardíacos de outras células imunes no miocárdio, especialmente macrófagos derivados de monócitos recrutados, é necessária uma estratégia de gating delicada elaborada. Primeiro, as células da linhagem linfoide são detectadas e excluídas de análises posteriores. Em seguida, as células mieloides são identificadas com macrófagos residentes sendo determinados pela alta expressão de CD45 e CD11b e baixa expressão de Ly6C. Com a classificação celular, macrófagos cardíacos isolados podem então ser cultivados in vitro durante vários dias para uma investigação mais aprofundada. Descrevemos, portanto, um protocolo para isolar macrófagos residentes cardíacos localizados dentro do sistema de condução cardíaca. Discutimos armadilhas na microdissecação e digestão de SAN e AVN, e fornecemos uma estratégia de bloqueio para identificar, contar e classificar de forma confiável os macrófagos cardíacos por triagem celular ativada por fluorescência.
Introduction
O nó sinoatrial (SAN) inicia fisiologicamente o impulso elétrico e é, portanto, o principal marcapasso do coração. O nó atrioventricular (AVN) conduz o impulso elétrico dos átrios para os ventrículos e também atua como marcapasso subsidiário1. Em geral, a geração e condução de impulsos elétricos é um processo complexo que pode ser modulado por vários fatores2, incluindo macrófagos residentes em regiões SAN/AVN. Um estudo recente de Hulsmans et al. demonstra uma população específica de macrófagos residentes cardíacos que são enriquecidos na AVN e funcionam como atores-chave na manutenção de um batimento cardíaco constante3. Eles descobriram que os macrófagos são eletricamente acoplados aos cardiomiócitos e podem alterar as propriedades elétricas dos cardiomiócitos acoplados. Os autores também observam que essas células condutoras que se intercalam com macrófagos também estão presentes em outros componentes do sistema de condução cardíaca, como o SAN.
Atualmente, não se sabe ao máximo se o fenótipo dos macrófagos cardíacos residentes difere entre as regiões cardíacas. No entanto, tem sido demonstrado que o microambiente tecidual pode afetar a transcrição e a renovação proliferativa dos macrófagos teciduais4. Além disso, uma vez que o fenótipo dos cardiomiócitos demonstrou ser diferente entre as regiões, os efeitos funcionais dos macrófagos sobre os cardiomiócitos também podem ser específicos da região, mesmo que o próprio fenótipo dos macrófagos possa ser o mesmo. Portanto, mais estudos sobre regiões cardíacas específicas são necessários.
Estudos recentes têm demonstrado que, no estado estacionário, os macrófagos residentes no tecido são estabelecidos no pré-natal, surgindo independentemente da hematopoiese definitiva, e persistem até a idade adulta5. No entanto, após a depleção de macrófagos ou durante a inflamação cardíaca,os hi monócitos Ly6c contribuem para reabastecer a população de macrófagos cardíacos6. Estudos envolvendo rastreamento genético de linhagem, parabiose, mapeamento de destino e rastreamento celular mostraram a coexistência de uma variedade de populações de macrófagos residentes em tecidos em órgãos e tecidos e, também, diferentes comportamentos celulares de subconjuntos de macrófagos que estão potencialmente associados à sua ontogenia 7,8,9.
A caracterização de macrófagos cardíacos residentes tem se beneficiado do uso da classificação de células ativadas magnéticas (MACS) e da triagem de células ativadas fluorescentes. Esses métodos são particularmente úteis para isolar populações celulares específicas de múltiplas frações teciduais, rotulando-as com seus marcadores de superfície celular. Isso não só leva a uma maior pureza do tipo de célula imune isolada, mas também permite a análise fenotípica. Aqui, apresentamos um protocolo que inclui células revestidas de esferas magnéticas seguidas de triagem de células ativadas fluorescentes para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente isolados da região SAN e AVN.
Para explorar as características dos macrófagos residentes cardíacos no sistema de condução e sua função para condução cardíaca e arritmogênese, a localização precisa e a dissecção da SAN e da AVN são críticas. Para a microdissecção de SAN e AVN, são utilizados marcos anatômicos para a identificação da região10. Em resumo, a SAN está localizada na junção da veia cava superior e do átrio direito. A AVN está localizada dentro do triângulo de Koch, que é anteriormente delimitado pelo folheto septal da valva tricúspide e, posteriormente, pelo tendão de Todaro11. Também fornecemos um procedimento preciso de microdissecção de SAN e AVN em camundongos, que é confirmado por histologia e coloração por imunofluorescência.
Macrófagos residentes isolados poderiam ser usados para experimentos adicionais, como sequenciamento de RNA, ou poderiam ser recuperados e cultivados por mais de duas semanas, permitindo vários experimentos in vitro. Portanto, nosso protocolo descreve um procedimento altamente valioso para o imunorritmologista. A Tabela 1 mostra a composição de todas as soluções necessárias, a Figura 1 mostra os pontos de referência de microdissecção para SAN e AVN. A Figura 2 é uma ilustração esquemática da localização de SAN e AVN. A Figura 3 mostra a coloração histológica de SAN e AVN (coloração tricrômica e imunofluorescência de Masson). A Figura 4 mostra uma estratégia de bloqueio passo a passo para isolar macrófagos residentes cardíacos por meio da classificação celular ativada por fluorescência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente das regiões SAN e AVN em alta pureza.
Os macrófagos são divididos em subpopulações com base em sua localização anatômica e fenótipo funcional. Eles também podem mudar de um fenótipo funcional para outro em resposta a sinais microambientais variáveis13. Em comparação com outros órgãos, como medula óssea e fígado, o tecido cardíaco cont?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, para R. Xia), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 para S. Clauss, 81Z0600206 para S. Kääb, 81Z0600204 para CS), a Fundação Corona (S199/10079/2019 para S. Clauss), o SFB 914 (projeto Z01 para S. Massberg), o ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 para S. Clauss) e a Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (para S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
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