小鼠窦房和房室结常驻心脏巨噬细胞的分离和培养
Summary
这里介绍的方案提供了一种从小鼠心脏的窦房结（SAN）和房室结（AVN）区域分离心脏驻留巨噬细胞的分步方法。
Abstract
常驻心脏巨噬细胞已被证明可以促进心脏中的电传导。生理性心律由窦房结 （SAN） 中产生的电脉冲启动，然后通过房室结 （AVN） 传导至心室。为了进一步研究常驻巨噬细胞在心脏传导系统中的作用，有必要从SAN和AVN中适当分离常驻巨噬细胞，但这仍然具有挑战性。在这里，我们提供了一种方案，用于在小鼠心脏中可靠地显微解剖SAN和AVN，然后对常驻巨噬细胞进行分离和培养。
无论是位于终腔嵴与上腔静脉交界处的 SAN，还是位于科赫三角形顶点的 AVN，均被鉴定和显微解剖。通过对使用Masson三色染色和抗HCN4进行的组织学分析来确认正确的位置。
然后对显微解剖的组织进行酶消化以获得单细胞悬液，然后用针对细胞类型特定表面标志物的特定抗体组孵育。这允许通过荧光激活细胞分选来识别、计数或分离不同的细胞群。为了将心脏驻留巨噬细胞与心肌中的其他免疫细胞（尤其是募集的单核细胞来源的巨噬细胞）区分开来，需要一种精心设计的门控策略。首先，检测淋巴谱系细胞并将其排除在进一步分析之外。然后，通过CD45和CD11b的高表达以及Ly6C的低表达来鉴定髓系细胞和常驻巨噬细胞。通过细胞分选，可以在体外培养分离的心脏巨噬细胞数天以进行进一步研究。因此，我们描述了一种分离位于心脏传导系统内的心脏驻留巨噬细胞的方案。我们讨论了显微解剖和消化SAN和AVN的陷阱，并提供了一种门控策略，通过荧光激活细胞分选可靠地鉴定，计数和分选心脏巨噬细胞。
Introduction
窦房结 （SAN） 在生理上启动电脉冲，因此是心脏的主要起搏器。房室结 （AVN） 将电脉冲从心房传导到心室，并充当辅助起搏器1。一般来说，电脉冲的产生和传导是一个复杂的过程，可以通过各种因素2进行调节，包括SAN/AVN区域中的常驻巨噬细胞。Hulsmans等人最近的一项研究表明，心脏驻留巨噬细胞的特定群体富含AVN，并作为保持稳定心跳的关键参与者3。他们发现巨噬细胞与心肌细胞电偶联，可以改变偶联心肌细胞的电特性。作者还指出，这种与巨噬细胞交错的传导细胞也存在于心脏传导系统的其他组件中，例如SAN。
目前，尚不完全清楚常驻心脏巨噬细胞的表型是否在心脏区域之间有所不同。然而，已经表明，组织微环境可以影响组织巨噬细胞的转录和增殖更新4。此外，由于心肌细胞表型已被证明在区域之间是不同的，因此巨噬细胞对心肌细胞的功能作用也可能是区域特异性的，即使巨噬细胞表型本身可能相同。因此，需要对特定的心脏区域进行进一步的研究。
最近的研究表明，在稳定状态下，组织驻留巨噬细胞在产前建立，独立于确定性造血而产生，并持续到成年期5。然而，在巨噬细胞耗竭后或心脏炎症期间，Ly6chi单核细胞有助于补充心脏巨噬细胞群6。涉及遗传谱系追踪、共生、命运映射和细胞追踪的研究表明，器官和组织中存在多种组织驻留巨噬细胞群，以及可能与其个体发生相关的巨噬细胞亚群的不同细胞行为7，8，9。
常驻心脏巨噬细胞的表征得益于磁活化细胞分选（MACS）和荧光活化细胞分选的使用。这些方法对于通过用细胞表面标记物标记从多个组织组分中分离特定细胞群特别有用。这不仅导致分离的免疫细胞类型的纯度更高，而且还允许表型分析。在这里，我们提出了一个方案，包括磁珠包被的细胞，然后进行荧光活化细胞分选，以富集从SAN和AVN区域特异性分离的心脏驻留巨噬细胞。
为了探究心脏驻留巨噬细胞在传导系统中的特性及其对心脏传导和心律失常发生的功能，SAN和AVN的精确定位和解剖至关重要。对于SAN和AVN的显微解剖，解剖标志用于区域识别10。简而言之，SAN位于上腔静脉和右心房的交界处。AVN位于Koch三角形内，其前边界为三尖瓣的隔叶，后部与Todaro11的肌腱接壤。我们还提供小鼠SAN和AVN的准确显微切割程序，并通过组织学和免疫荧光染色得到证实。
分离的常驻巨噬细胞可用于进一步的实验，例如RNA测序，或者可以回收和培养两周以上，允许各种体外实验。因此，我们的协议描述了免疫节律学家非常有价值的程序。 表 1 显示了所需所有解决方案的组成，图 1 显示了 SAN 和 AVN 的显微切割特征。 图 2 是 SAN 和 AVN 本地化的示意图。 图3 显示了SAN和AVN的组织学染色（Masson的三色和免疫荧光染色）。 图4 显示了通过荧光激活细胞分选分离心脏驻留巨噬细胞的分步门控策略。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇手稿中，我们描述了一种方案，用于以高纯度富集来自SAN和AVN区域的心脏常驻巨噬细胞。
巨噬细胞根据其解剖位置和功能表型分为亚群。它们还可以响应可变的微环境信号从一种功能表型切换到另一种功能表型13。与骨髓和肝脏等其他器官相比，心脏组织包含较低百分比的免疫细胞和较低的每个细胞亚群的绝对数量14。因此，细胞分?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家留学基金委（CSC，致夏瑞）、德国心血管研究中心（DZHK;81X2600255 致 S. Clauss、81Z0600206 致 S. Kääb、81Z0600204 致 CS）、科罗纳基金会（S199/10079/2019 致 S. Clauss）、SFB 914（项目 Z01 致 S. Massberg）、ERA-NET on 心血管疾病（ERA-CVD;01KL1910 至 S. Clauss）和 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung（致 S. Clauss）的支持。资助者在手稿准备中没有任何作用。
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
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