Isolering og kultur af residente hjertemakrofager fra Murine Sinoatrial og Atrioventricular Node
Summary
Protokollen, der præsenteres her, giver en trinvis tilgang til isolering af hjerteboende makrofager fra sinoatrialknuden (SAN) og atrioventrikulær knude (AVN) region af musehjerter.
Abstract
Residente hjertemakrofager har vist sig at lette den elektriske ledning i hjertet. Den fysiologiske hjerterytme initieres af elektriske impulser genereret i sinoatrialknude (SAN) og ledes derefter til ventrikler via atrioventrikulær knude (AVN). For yderligere at studere beboermakrofagernes rolle i hjerteledningssystemet er en ordentlig isolering af residente makrofager fra SAN og AVN nødvendig, men det er stadig udfordrende. Her leverer vi en protokol til pålidelig mikrodissektion af SAN og AVN i murinehjerter efterfulgt af isolering og kultur af residente makrofager.
Både SAN, der er placeret ved krydset mellem crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN, der er placeret i toppen af Koch-trekanten, identificeres og mikrodissekeres. Korrekt placering bekræftes ved histologisk analyse af vævet udført med Massons trikrome plet og ved anti-HCN4.
Mikrodissekeret væv fordøjes derefter enzymatisk for at opnå enkeltcellesuspensioner efterfulgt af inkubation med et specifikt panel af antistoffer rettet mod celletypespecifikke overflademarkører. Dette gør det muligt at identificere, tælle eller isolere forskellige cellepopulationer ved fluorescerende aktiveret cellesortering. For at differentiere hjerteboende makrofager fra andre immunceller i myokardiet, især rekrutterede monocytafledte makrofager, er der behov for en delikat udtænkt gatingstrategi. For det første detekteres lymfoide afstamningsceller og udelukkes fra yderligere analyse. Derefter identificeres myeloide celler med residente makrofager, der bestemmes ved høj ekspression af både CD45 og CD11b og lav ekspression af Ly6C. Med cellesortering kan isolerede hjertemakrofager derefter dyrkes in vitro over flere dage til yderligere undersøgelse. Vi beskriver derfor en protokol til isolering af hjerteboende makrofager placeret i hjerteledningssystemet. Vi diskuterer faldgruber ved mikrodissekering og fordøjelse af SAN og AVN og giver en gating-strategi til pålideligt at identificere, tælle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.
Introduction
Sinoatrialknuden (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impuls og er derfor hjertets primære pacemaker. Den atrioventrikulære knude (AVN) leder den elektriske impuls fra atrierne til ventriklerne og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning af elektriske impulser en kompleks proces, der kan moduleres af forskellige faktorer2, herunder resident makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig undersøgelse af Hulsmans et al. viser en specifik population af hjerteboende makrofager, der er beriget i AVN og fungerer som nøgleaktører i at holde et stabilt hjerteslag3. De fandt ud af, at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytterne og kunne ændre de elektriske egenskaber af koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemærker også, at sådanne ledende celler, der forbinder med makrofager, også er til stede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, såsom SAN.
I øjeblikket er det ikke fuldt ud kendt, om fænotypen af hjemmehørende hjertemakrofager adskiller sig mellem hjerteregionerne. Det har imidlertid vist sig, at vævsmikromiljøet kan påvirke transkription og proliferativ fornyelse af vævsmakrofager4. Da kardiomyocytfænotypen har vist sig at være forskellig mellem regioner, kan de funktionelle virkninger af makrofager på kardiomyocytter også være regionsspecifikke, selvom makrofagfænotypen selv kan være den samme. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser af specifikke hjerteregioner.
Nylige undersøgelser har vist, at vævsresidente makrofager ved steady state etableres prænatalt, opstår uafhængigt af endelig hæmatopoiesis og vedvarer ind i voksenalderen5. Efter makrofagudtømning eller under hjertebetændelse bidrager Ly6chi monocytter imidlertid til at genopbygge hjertemakrofagpopulationen6. Undersøgelser, der involverer genetisk afstamningssporing, parabiose, skæbnekortlægning og cellesporing, viste sameksistensen af en række vævsresidente makrofagpopulationer i organer og væv og også forskellige cellulære adfærd af makrofagundergrupper, der potentielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering af residente hjertemakrofager har nydt godt af brugen af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) og fluorescerende aktiveret cellesortering. Disse metoder er især nyttige til isolering af specifikke cellepopulationer fra flere vævsfraktioner ved at mærke dem med deres celleoverflademarkører. Dette fører ikke kun til en højere renhed af den isolerede immuncelletype, men giver også mulighed for fænotypisk analyse. Her præsenterer vi en protokol, der inkluderer magnetiske perlebelagte celler efterfulgt af fluorescerende aktiveret cellesortering til berigelse af hjerteboende makrofager specifikt isoleret fra SAN- og AVN-regionen.
For at undersøge egenskaberne ved hjerteboende makrofager i ledningssystemet og deres funktion til hjerteledning og arytmogenese er præcis lokalisering og dissektion af SAN og AVN kritisk. Til mikrodissektion af SAN og AVN anvendes anatomiske vartegn til regionsidentifikation10. Kort sagt er SAN placeret ved krydset mellem den overlegne vena cava og højre atrium. AVN er placeret inden for trekanten af Koch, som er anteriort omgivet af septalbrochuren af tricuspidventilen og bagud af senen af Todaro11. Vi leverer også en nøjagtig mikrodissektionsprocedure af SAN og AVN hos mus, som bekræftes af histologi og immunfluorescensfarvning.
Isolerede residente makrofager kunne bruges til yderligere eksperimenter såsom RNA-sekventering eller kunne genvindes og dyrkes i mere end to uger, hvilket tillod forskellige in vitro-eksperimenter. Derfor beskriver vores protokol en meget værdifuld procedure for immuno-rytmikologen. Tabel 1 viser sammensætningen af alle de nødvendige løsninger, figur 1 viser mikrodissektionsmærkerne for SAN og AVN. Figur 2 er skematisk illustration af SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser den histologiske farvning af SAN og AVN (Massons trichrom- og immunfluorescensfarvning). Figur 4 viser en trin-for-trin gating-strategi til isolering af hjerteboende makrofager ved fluorescensaktiveret cellesortering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en protokol for berigelse af hjerteboende makrofager specifikt fra SAN- og AVN-regionerne ved høj renhed.
Makrofager er opdelt i subpopulationer baseret på deres anatomiske placering og funktionelle fænotype. De kan også skifte fra en funktionel fænotype til en anden som reaktion på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer såsom knoglemarv og lever indeholder hjertevæv en lavere procentdel af immunceller og l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-og-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Bidragyderne havde ingen rolle i manuskriptforberedelsen.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
