Isolement et culture de macrophages cardiaques résidents du nœud sino-auriculaire murin et auriculo-ventriculaire
Summary
Le protocole présenté ici fournit une approche étape par étape pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents de la région du ganglion sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) du cœur de souris.
Abstract
Il a été démontré que les macrophages cardiaques résidents facilitent la conduction électrique dans le cœur. Le rythme cardiaque physiologique est initié par des impulsions électriques générées dans le nœud sino-auriculaire (SAN), puis conduites vers les ventricules via le nœud auriculo-ventriculaire (AVN). Pour étudier plus avant le rôle des macrophages résidents dans le système de conduction cardiaque, une isolation appropriée des macrophages résidents du SAN et de l’AVN est nécessaire, mais cela reste difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour la microdissection fiable du SAN et de l’AVN dans les cœurs murins, suivie de l’isolement et de la culture des macrophages résidents.
Le SAN, situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure, et l’AVN, situé au sommet du triangle de Koch, sont identifiés et microdisséqués. L’emplacement correct est confirmé par l’analyse histologique du tissu réalisée avec la coloration trichrome de Masson et par l’anti-HCN4.
Les tissus microdisséqués sont ensuite digérés par voie enzymatique pour obtenir des suspensions unicellulaires suivies de l’incubation avec un panel spécifique d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire. Cela permet d’identifier, de compter ou d’isoler différentes populations cellulaires par tri cellulaire activé par fluorescence. Pour différencier les macrophages cardiaques résidents des autres cellules immunitaires du myocarde, en particulier des macrophages dérivés de monocytes recrutés, une stratégie de déclenchement délicate est nécessaire. Tout d’abord, les cellules de la lignée lymphoïde sont détectées et exclues d’une analyse plus approfondie. Ensuite, les cellules myéloïdes sont identifiées avec des macrophages résidents déterminés par une expression élevée de CD45 et CD11b, et une faible expression de Ly6C. Avec le tri cellulaire, des macrophages cardiaques isolés peuvent ensuite être cultivés in vitro pendant plusieurs jours pour une étude plus approfondie. Nous décrivons donc un protocole pour isoler les macrophages résidents cardiaques situés dans le système de conduction cardiaque. Nous discutons des pièges de la microdissection et de la digestion du SAN et de l’AVN, et fournissons une stratégie de contrôle pour identifier, compter et trier de manière fiable les macrophages cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.
Introduction
Le nœud sino-auriculaire (SAN) initie physiologiquement l’impulsion électrique et est donc le principal stimulateur cardiaque du cœur. Le nœud auriculo-ventriculaire (AVN) conduit l’impulsion électrique des oreillettes aux ventricules et agit également comme un stimulateur cardiaque auxiliaire1. En général, la génération et la conduction d’impulsions électriques est un processus complexe qui peut être modulé par divers facteurs2, y compris les macrophages résidents dans les régions SAN / AVN. Une étude récente de Hulsmans et al. démontre une population spécifique de macrophages cardiaques résidents qui sont enrichis en AVN et fonctionnent comme des acteurs clés dans le maintien d’un rythme cardiaque régulier3. Ils ont constaté que les macrophages sont couplés électriquement aux cardiomyocytes et pourraient modifier les propriétés électriques des cardiomyocytes couplés. Les auteurs notent également que de telles cellules conductrices s’entrelacent avec les macrophages sont également présentes dans d’autres composants du système de conduction cardiaque, tels que le SAN.
Actuellement, on ne sait pas exactement si le phénotype des macrophages cardiaques résidents diffère entre les régions cardiaques. Cependant, il a été démontré que le microenvironnement tissulaire peut affecter la transcription et le renouvellement prolifératif des macrophages tissulaires4. De plus, puisqu’il a été démontré que le phénotype des cardiomyocytes est différent d’une région à l’autre, les effets fonctionnels des macrophages sur les cardiomyocytes peuvent également être spécifiques à une région, même si le phénotype du macrophage lui-même peut être le même. Par conséquent, d’autres études sur des régions cardiaques spécifiques sont nécessaires.
Des études récentes ont démontré qu’à l’état d’équilibre, les macrophages résidents tissulaires sont établis avant la naissance, apparaissant indépendamment de l’hématopoïèse définitive, et persistent jusqu’à l’âge adulte5. Cependant, après l’épuisement des macrophages ou lors d’une inflammation cardiaque, les monocytes Ly6chi contribuent à reconstituer la population de macrophages cardiaques6. Des études impliquant le traçage génétique de la lignée, la parabiose, la cartographie du destin et le suivi cellulaire ont montré la coexistence d’une variété de populations de macrophages résidents dans les organes et les tissus, ainsi que le comportement cellulaire différent des sous-ensembles de macrophages potentiellement associés à leur ontogenèse 7,8,9.
La caractérisation des macrophages cardiaques résidents a bénéficié de l’utilisation du tri des cellules activées magnétiques (MACS) et du tri des cellules activées par fluorescence. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour isoler des populations cellulaires spécifiques de plusieurs fractions tissulaires en les marquant avec leurs marqueurs de surface cellulaire. Cela conduit non seulement à une plus grande pureté du type de cellule immunitaire isolée, mais permet également une analyse phénotypique. Ici, nous présentons un protocole comprenant des cellules recouvertes de billes magnétiques suivies d’un tri cellulaire activé par fluorescence pour l’enrichissement des macrophages résidents cardiaques spécifiquement isolés de la région SAN et AVN.
Pour explorer les caractéristiques des macrophages cardiaques résidents dans le système de conduction et leur fonction pour la conduction cardiaque et l’arythmogenèse, une localisation et une dissection précises du SAN et de l’AVN sont essentielles. Pour la microdissection du SAN et de l’AVN, des repères anatomiques sont utilisés pour l’identification de la région10. En bref, le SAN est situé à la jonction de la veine cave supérieure et de l’oreillette droite. AVN est situé dans le triangle de Koch, qui est bordé antérieurement par le feuillet septal de la valve tricuspide, et postérieurement par le tendon de Todaro11. Nous fournissons également une procédure de microdissection précise du SAN et de l’AVN chez la souris, confirmée par histologie et coloration par immunofluorescence.
Des macrophages résidents isolés pourraient être utilisés pour d’autres expériences telles que le séquençage de l’ARN ou pourraient être récupérés et cultivés pendant plus de deux semaines, ce qui permettrait diverses expériences in vitro. Par conséquent, notre protocole décrit une procédure très précieuse pour l’immuno-rythmologiste. Le tableau 1 montre la composition de toutes les solutions nécessaires, la figure 1 montre les repères de microdissection pour SAN et AVN. La figure 2 illustre schématiquement la localisation SAN et AVN. La figure 3 montre la coloration histologique du SAN et de l’AVN (coloration trichrome et immunofluorescence de Masson). La figure 4 montre une stratégie de contrôle étape par étape pour isoler les macrophages résidents cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’enrichissement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement des régions SAN et AVN à haute pureté.
Les macrophages sont divisés en sous-populations en fonction de leur emplacement anatomique et de leur phénotype fonctionnel. Ils peuvent également passer d’un phénotype fonctionnel à un autre en réponse à des signaux microenvironnementaux variables13. Comparativement à d’autres organes comme …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb, 81Z0600204 à C.S.), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à S. Massberg), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
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