בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.
Abstract
מקרופאגים לבביים מקומיים הוכחו כמקלים על ההולכה החשמלית בלב. קצב הלב הפיזיולוגי מופעל על ידי דחפים חשמליים הנוצרים בצומת הסינואטרלי (SAN) ולאחר מכן מוליכים אותם לחדרים דרך צומת אטריובנטריקולרי (AVN). כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של מקרופאגים תושבים במערכת הולכת הלב, יש צורך בבידוד נכון של מקרופאגים תושבים מ-SAN ו-AVN, אך הוא עדיין מאתגר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה אמינה של ה-SAN וה-AVN בלבבות מורין ואחריה הבידוד והתרבות של מקרופאגים מקומיים.
שניהם, SAN אשר ממוקם בצומת של crista terminalis עם הווריד הנבוב העליון, ו AVN אשר ממוקם בקצה המשולש של קוך, מזוהים microdissected. מיקום נכון מאושר על ידי ניתוח היסטולוגי של הרקמה המבוצע עם כתם טריכרום של מסון ועל ידי אנטי HCN4.
לאחר מכן, רקמות מיקרו-דיסקרטיות מתעכלות באופן אנזימטי כדי לקבל תרחיפים של תאים בודדים ולאחר מכן הדגירה עם פאנל מסוים של נוגדנים המכוונים נגד סמני פני שטח ספציפיים מסוג תא. זה מאפשר לזהות, לספור או לבודד אוכלוסיות תאים שונות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כדי להבדיל בין מקרופאגים תושבי לב לבין תאים חיסוניים אחרים בשריר הלב, במיוחד מקרופאגים שמקורם במונוציטים, יש צורך באסטרטגיית גיתור עדינה. ראשית, תאי שושלת לימפואידים מזוהים ואינם נכללים בניתוח נוסף. לאחר מכן, תאים מיאלואידים מזוהים עם מקרופאגים מקומיים הנקבעים על ידי ביטוי גבוה של CD45 ו- CD11b, וביטוי נמוך של Ly6C. באמצעות מיון תאים, ניתן לטפח מקרופאגים לבביים מבודדים במבחנה במשך מספר ימים לצורך חקירה נוספת. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד מקרופאגים תושבי לב הממוקמים בתוך מערכת ההולכה הלבבית. אנו דנים במלכודות במיקרו-דיסקציה ובעיכול SAN ו-AVN, ומספקים אסטרטגיית גידור לזיהוי, ספירה ומיון אמינים של מקרופאגים לבביים על-ידי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה.
Introduction
הצומת הסינואטריאלי (SAN) יוזם פיזיולוגית את הדחף החשמלי ולכן הוא קוצב הלב העיקרי של הלב. הצומת האטריובנטריקולרי (AVN) מוליך את הדחף החשמלי מהאטריה אל החדרים ופועל גם כקוצב לב בת1. באופן כללי, ייצור והולכה של דחפים חשמליים הוא תהליך מורכב שניתן לווסת על ידי גורמים שונים2, כולל מקרופאגים תושבים באזורי SAN/AVN. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Hulsmans et al. מדגים אוכלוסייה ספציפית של מקרופאגים תושבי לב המועשרים ב- AVN ומתפקדים כשחקני מפתח בשמירה על דופק יציב3. הם מצאו כי מקרופאגים מצומדים חשמלית לקרדיומיוציטים ויכולים לשנות את התכונות החשמליות של קרדיומיוציטים מצומדים. המחברים מציינים גם כי תאים מוליכים כאלה המשולבים עם מקרופאגים נמצאים גם ברכיבים אחרים של מערכת ההולכה הלבבית, כגון SAN.
נכון לעכשיו, לא ידוע אם הפנוטיפ של מקרופאגים לבביים תושבים שונה בין אזורי הלב. עם זאת, הוכח כי מיקרו-סביבה של רקמות יכולה להשפיע על שעתוק והתחדשות שגשוג של מקרופאגים רקמתיים4. יתר על כן, מאחר שפנוטיפ הקרדיומיוציטים הוכח כשונה בין אזורים, ההשפעות התפקודיות של מקרופאגים על קרדיומיוציטים עשויות להיות גם ספציפיות לאזור, גם אם הפנוטיפ של המקרופאגים עצמו עשוי להיות זהה. לכן, יש צורך במחקרים נוספים על אזורי לב ספציפיים.
מחקרים אחרונים הראו כי במצב יציב, המקרופאגים השוכנים ברקמה נקבעים לפני הלידה, נובעים ללא תלות בהמטופויזה סופית, ונמשכים לבגרות5. עם זאת, לאחר דלדול מקרופאגים או במהלך דלקת לב, Ly6cהיי מונוציטים לתרום לחידוש אוכלוסיית מקרופאגים לבביים6. מחקרים שכללו מעקב אחר שושלת גנטית, פרביוזה, מיפוי גורלות ומעקב אחר תאים הראו את הדו-קיום של מגוון אוכלוסיות מקרופאגים תושבי רקמות באיברים וברקמות, וכן, התנהגות תאית שונה של תת-קבוצות מקרופאגים שעשויות להיות קשורות לאונטוגניה שלהם 7,8,9.
האפיון של מקרופאגים לבביים מקומיים נהנה משימוש במיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS) ומיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. שיטות אלה שימושיות במיוחד לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות משברי רקמות מרובים על ידי תיווגם עם סמני פני התא שלהם. זה לא רק מוביל לטוהר גבוה יותר של סוג התא החיסוני המבודד, אלא גם מאפשר ניתוח פנוטיפי. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל תאים מצופים חרוזים מגנטיים ולאחר מכן מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים להעשרת מקרופאגים תושבי לב שבודדו במיוחד מאזור SAN ו- AVN.
כדי לחקור את המאפיינים של מקרופאגים תושבי לב במערכת ההולכה ואת תפקודם עבור הולכה לבבית והפרעות קצב, לוקליזציה מדויקת ודיסקציה של SAN ו- AVN הם קריטיים. עבור מיקרודיסקציה של SAN ו- AVN, ציוני דרך אנטומיים משמשים לזיהוי האזור10. בקצרה, SAN ממוקם בצומת של הווריד הנבוב העליון והאטריום הימני. AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך, אשר גובל קדמית על ידי עלון מחיצה של שסתום tricuspid, ומאחור על ידי הגיד של Todaro11. אנו מספקים גם הליך מיקרו-דיסקציה מדויק של SAN ו- AVN בעכברים אשר אושר על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
מקרופאגים מקומיים מבודדים יכולים לשמש לניסויים נוספים כגון ריצוף RNA או שניתן לשחזר ולטפח אותם במשך יותר משבועיים ולאפשר ניסויים שונים במבחנה. לכן, הפרוטוקול שלנו מתאר הליך בעל ערך רב עבור האימונו-ריתמולוג. טבלה 1 מציגה את ההרכב של כל הפתרונות הדרושים, איור 1 מראה את ציוני הדרך של מיקרו-דיסקציה עבור SAN ו-AVN. איור 2 הוא המחשה סכמטית של לוקליזציה של SAN ו-AVN. איור 3 מראה את הכתמים ההיסטולוגיים של SAN ו-AVN (הכתם הטריכרום והאימונופלואורסצנציה של מאסון). איור 4 מראה אסטרטגיית מיון שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול להעשרת מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזורי SAN ו- AVN בטוהר גבוה.
מקרופאגים מחולקים לתת-אוכלוסיות על סמך מיקומם האנטומי והפנוטיפ התפקודי שלהם. הם יכולים גם לעבור מפנוטיפ פונקציונלי אחד למשנהו בתגובה לאותות מיקרו-סביבתיים משתנים13. בהשו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל- R. Xia), המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK; 81X2600255 ל- S. Clauss, 81Z0600206 ל- S. Kääb, 81Z0600204 ל- C.S.), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל- S. Massberg), ה- ERA-NET למחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל- S. Clauss) וקרן היינריך ולוטה מולפנצל (ל- S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
