マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養
Summary
ここで紹介するプロトコルは、マウス心臓の洞房結節(SAN)および房室結節(AVN)領域から心臓常在マクロファージを単離するための段階的なアプローチを提供します。
Abstract
常在する心臓マクロファージは、心臓における電気伝導を促進することが実証されている。生理学的な心調律は、洞房結節(SAN)で生成された電気インパルスによって開始され、房室結節(AVN)を介して心室に伝導されます。心臓伝導系における常在マクロファージの役割をさらに研究するには、常在マクロファージをSANおよびAVNから適切に分離する必要がありますが、依然として困難です。ここでは、マウス心臓におけるSANとAVNの信頼性の高いマイクロダイセクションとそれに続く常在マクロファージの単離と培養のためのプロトコルを提供します。
クリスタターミナルと上大静脈の接合部に位置するSANと、コッホの三角形の頂点に位置するAVNの両方が同定され、マイクロディスセクションされます。正しい位置は、マッソンのトリクローム染色および抗HCN4で行われた組織の組織学的分析によって確認されます。
次に、マイクロ解剖組織を酵素的に消化して単一細胞懸濁液を取得し、続いて細胞型特異的表面マーカーに対する抗体の特異的パネルとインキュベートします。これにより、蛍光活性化細胞ソーティングによって異なる細胞集団を同定、カウント、または単離することができる。心臓に常在するマクロファージを心筋内の他の免疫細胞、特に動員された単球由来のマクロファージと区別するには、繊細なゲーティング戦略が必要です。まず、リンパ系譜細胞を検出し、さらなる分析から除外します。次に、骨髄系細胞は、CD45およびCD11bの両方の高発現、およびLy6Cの低発現によって決定される常在マクロファージと同定される。細胞選別により、単離された心臓マクロファージをin vitroで数日間培養し、さらなる調査を行うことができます。したがって、心臓伝導系内にある心臓常在マクロファージを単離するためのプロトコルについて説明します。SANとAVNのマイクロ解剖と消化の落とし穴について説明し、蛍光活性化細胞ソーティングによって心臓マクロファージを確実に識別、カウント、およびソートするためのゲーティング戦略を提供します。
Introduction
洞房結節(SAN)は生理学的に電気インパルスを開始するため、心臓の主要なペースメーカーです。房室結節(AVN)は、心房から心室に電気インパルスを伝導し、補助ペースメーカーとしても機能します1。一般に、電気インパルスの生成と伝導は、SAN/AVN領域に常在するマクロファージを含むさまざまな要因2によって調節できる複雑なプロセスです。Hulsmansらによる最近の研究は、AVNに富み、安定した心拍を維持するための主要なプレーヤーとして機能する心臓常在マクロファージの特定の集団を示しています3。彼らは、マクロファージが心筋細胞と電気的に結合しており、結合した心筋細胞の電気的特性を変化させる可能性があることを発見しました。著者たちはまた、マクロファージとインターリーブするこのような伝導細胞が、SANなどの心臓伝導系の他の構成要素にも存在することも指摘している。
現在、常在する心臓マクロファージの表現型が心臓領域間で異なるかどうかは完全にはわかっていません。しかし、組織微小環境が組織マクロファージの転写および増殖再生に影響を及ぼし得ることが示されている4。さらに、心筋細胞の表現型は領域間で異なることが実証されているため、マクロファージの心筋細胞に対する機能的影響も、マクロファージ表現型自体が同じであっても、領域特異的であり得る。したがって、特定の心臓領域に関するさらなる研究が必要です。
最近の研究では、定常状態では、組織常在マクロファージが出生前に確立され、確定的な造血とは無関係に発生し、成人期まで持続することが示されています5。しかし、マクロファージ枯渇後または心臓炎症中に、Ly6chi単球は心臓マクロファージ集団6の補充に寄与する。遺伝的系統追跡、パラビオシス、運命マッピング、および細胞追跡を含む研究は、臓器や組織にさまざまな組織常在マクロファージ集団が共存していること、および個体発生に関連する可能性のあるマクロファージサブセットの異なる細胞挙動を示しました7,8,9。
常在する心臓マクロファージの特性評価は、磁気活性化細胞選別(MACS)および蛍光活性化細胞選別の使用から恩恵を受けています。これらの方法は、細胞表面マーカーで標識することにより、複数の組織画分から特定の細胞集団を単離するのに特に有用です。これにより、単離された免疫細胞型の純度が高くなるだけでなく、表現型分析も可能になります。ここでは、磁気ビーズでコーティングされた細胞とそれに続く、SANおよびAVN領域から特異的に分離された心臓常在マクロファージの濃縮のための蛍光活性化細胞ソーティングを含むプロトコルを紹介します。
伝導系における心臓常在マクロファージの特徴と、心臓伝導や不整脈形成に対するその機能を探索するためには、SANとAVNの正確な局在と解剖が重要です。SANおよびAVNの微小解剖のために、解剖学的ランドマークが領域識別10に使用される。簡単に言うと、SANは上大静脈と右心房の接合部に位置しています。AVNは、三尖弁の中隔リーフレットによって前方に隣接し、後方にトダロ11の腱によって囲まれているコッホの三角形内に位置しています。また、組織学および免疫蛍光染色によって確認されるマウスのSANおよびAVNの正確なマイクロ解剖手順を提供します。
単離された常在マクロファージは、RNAシーケンシングなどのさらなる実験に使用したり、回収して2週間以上培養したりして、さまざまなin vitro実験を行うことができます。したがって、私たちのプロトコルは、免疫リズム学者にとって非常に価値のある手順を説明しています。 表 1は、必要なすべてのソリューションの構成を示し、 図1 は、SANとAVNのマイクロダイセクションのランドマークを示しています。 図2は、SANとAVNのローカリゼーションの概略 図 です。 図3 は、SANおよびAVNの組織学的染色(マッソントリクロームおよび免疫蛍光染色)を示す。 図4 は、蛍光活性化細胞選別によって心臓常在マクロファージを単離するための段階的なゲーティング戦略を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、SANおよびAVN領域から特異的に心臓常在マクロファージを高純度で濃縮するためのプロトコルについて説明します。
マクロファージは、解剖学的位置と機能的表現型に基づいて亜集団に分けられます。それらはまた、可変微小環境信号に応答して、ある機能的表現型から別の機能的表現型に切り替えることができる13。骨髄や肝臓などの他…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国奨学金評議会(CSC、R.Xia)、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK、81X2600255からS.クラウス、81Z0600206からS.Kääb、81Z0600204からC.S.)、コロナ財団(S199/10079/2019からS.クラウス)、SFB 914(プロジェクトZ01からS.マスバーグ)、心血管疾患に関するERA-NET(ERA-CVD、01KL1910からS.クラウス)、およびハインリッヒアンドロッテミュールフェンツル財団(S.クラウス)。資金提供者は原稿の準備に何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
