쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.
Abstract
상주 심장 대 식세포는 심장에서 전기 전도를 촉진하는 것으로 입증되었습니다. 생리적 심장 리듬은 동방 결절 (SAN)에서 생성 된 전기 충격에 의해 시작된 다음 방실 결절 (AVN)을 통해 심실로 전달됩니다. 심장 전도 시스템에서 상주 대식세포의 역할을 더 연구하려면 SAN 및 AVN에서 상주 대식세포를 적절하게 분리해야 하지만 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 쥐 심장에서 SAN 및 AVN의 신뢰할 수 있는 미세 해부를 위한 프로토콜을 제공하고 상주 대식세포의 분리 및 배양을 제공합니다.
크리스타 터미널과 상대 정맥의 교차점에 위치한 SAN과 Koch의 삼각형 정점에 위치한 AVN이 모두 식별되고 미세 해부됩니다. 정확한 위치는 Masson의 삼색 염색 및 항 -HCN4로 수행 된 조직의 조직 학적 분석에 의해 확인됩니다.
그런 다음 미세 해부 조직을 효소적으로 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포 유형 특정 표면 마커에 대해 지시된 특정 항체 패널과 함께 배양합니다. 이를 통해 형광 활성화 세포 분류를 통해 서로 다른 세포 집단을 식별, 계수 또는 분리할 수 있습니다. 심장 상주 대식세포를 심근의 다른 면역 세포, 특히 모집된 단핵구 유래 대식세포와 구별하기 위해서는 섬세하게 고안된 게이팅 전략이 필요합니다. 첫째, 림프 계통 세포를 검출하고 추가 분석에서 제외합니다. 이어서, 골수성 세포는 CD45 및 CD11b 둘 다의 높은 발현 및 Ly6C의 낮은 발현에 의해 결정되는 상주 대식세포로 확인된다. 세포 분류를 통해 분리된 심장 대식세포를 추가 조사를 위해 며칠 동안 시험관내에서 배양할 수 있습니다. 따라서 우리는 심장 전도 시스템 내에 위치한 심장 상주 대 식세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SAN 및 AVN의 미세 해부 및 소화의 함정에 대해 논의하고 형광 활성화 세포 분류를 통해 심장 대 식세포를 안정적으로 식별, 계수 및 분류하는 게이팅 전략을 제공합니다.
Introduction
동방 결절 (SAN)은 생리 학적으로 전기 충격을 시작하므로 심장의 주요 맥박 조정기입니다. 방실 결절 (AVN)은 심방에서 심실로 전기 충격을 전달하고 보조 심박 조율기1로도 작용합니다. 일반적으로, 전기 충격의 생성 및 전도는 SAN/AVN 영역의 상주 대식세포를 포함하는 다양한 인자2에 의해 조절될 수 있는 복잡한 과정이다. Hulsmans et al.의 최근 연구는 AVN이 풍부하고 꾸준한 심장 박동을 유지하는 데 핵심 역할을 하는 심장 상주 대식세포의 특정 집단을보여줍니다3. 그들은 대 식세포가 심근 세포에 전기적으로 결합되어 결합 된 심근 세포의 전기적 특성을 변화시킬 수 있음을 발견했습니다. 저자들은 또한 대식세포와 인터리빙하는 이러한 전도성 세포가 SAN과 같은 심장 전도 시스템의 다른 구성 요소에도 존재한다는 점에 주목합니다.
현재, 상주 심장 대 식세포의 표현형이 심장 영역마다 다른지 여부는 완전히 알려져 있지 않습니다. 그러나, 조직 미세 환경이 조직 대 식세포의 전사 및 증식 재생에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다4. 또한, 심근세포 표현형이 영역마다 상이한 것으로 입증되었기 때문에, 심근세포에 대한 대식세포의 기능적 효과는 대식세포 표현형 자체가 동일할 수 있다 하더라도 또한 영역-특이적일 수 있다. 따라서 특정 심장 부위에 대한 추가 연구가 필요합니다.
최근 연구에 따르면 정상 상태에서 조직 상주 대식세포는 태아기에 확립되어 최종 조혈과 독립적으로 발생하며 성인기까지지속됩니다5. 그러나, 대식세포 고갈 후 또는 심장 염증 동안, Ly6chi 단핵구는 심장 대식세포 집단을 보충하는데 기여한다6. 유전적 계통 추적, parabiosis, 운명 매핑 및 세포 추적과 관련된 연구는 장기 및 조직에 다양한 조직 상주 대식세포 집단의 공존, 그리고 또한 잠재적으로 그들의 개체 발생과 관련된 대식세포 하위 세트의 상이한 세포 행동을 보여주었다 7,8,9.
상주 심장 대식세포의 특성화는 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류의 사용으로부터 이익을 얻었습니다. 이러한 방법은 세포 표면 마커로 표지하여 여러 조직 분획으로부터 특정 세포 집단을 분리하는 데 특히 유용합니다. 이는 분리된 면역 세포 유형의 순도를 높일 뿐만 아니라 표현형 분석도 가능하게 합니다. 여기에서는 SAN 및 AVN 영역으로부터 특이적으로 분리된 심장 상주 대식세포의 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류와 함께 자성 비드 코팅 세포를 포함하는 프로토콜을 제시합니다.
전도 시스템에서 심장 상주 대식세포의 특성과 심장 전도 및 부정맥 발생에 대한 기능을 탐구하려면 SAN 및 AVN의 정확한 위치 파악 및 해부가 중요합니다. SAN 및 AVN의 미세 해부를 위해, 해부학적 랜드마크가 영역 식별(10)에 사용된다. 간단히 말해서, SAN은 상대 정맥과 우심방의 교차점에 위치합니다. AVN은 Koch의 삼각형 내에 위치하고 있으며, 앞쪽으로는 삼첨판 막의 중격 전단지와 접해 있고 뒤쪽으로는 Todaro11의 힘줄에 의해 접해 있습니다. 우리는 또한 조직학 및 면역 형광 염색으로 확인 된 마우스에서 SAN 및 AVN의 정확한 미세 해부 절차를 제공합니다.
분리된 상주 대식세포는 RNA 시퀀싱과 같은 추가 실험에 사용되거나 다양한 시험관 내 실험을 허용할 수 있도록 2주 이상 회수 및 배양될 수 있습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 면역 리듬 학자에게 매우 가치있는 절차를 설명합니다. 표 1은 필요한 모든 용액의 조성을 보여주고, 도 1 은 SAN 및 AVN에 대한 미세해부 랜드마크를 나타낸다. 도 2 는 SAN 및 AVN 국소화의 개략도이다. 도 3 은 SAN 및 AVN의 조직학적 염색(Masson’s trichrome 및 면역형광 염색)을 나타낸다. 도 4 는 형광-활성화 세포 분류에 의해 심장 상주 대식세포를 분리하기 위한 단계별 게이팅 전략을 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서, 우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 고순도로 심장 상주 대 식세포를 농축하기위한 프로토콜을 기술한다.
대 식세포는 해부학 적 위치와 기능적 표현형에 따라 하위 집단으로 나뉩니다. 그들은 또한 가변 미세 환경 신호에 반응하여 하나의 기능적 표현형에서 다른 기능적 표현형으로 전환 할 수 있습니다13. 골수 및 간과 같은 다른 기관과 비교?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 장학위원회 (CSC, R. Xia), 독일 심혈관 연구 센터 (DZHK; 81X2600255에서 S. Clauss로, 81Z0600206에서 S. Kääb로, 81Z0600204에서 CS), 코로나 재단 (S199/10079/2019에서 S. Clauss까지), SFB 914 (프로젝트 Z01에서 S. Massberg까지), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910에서 S. Clauss까지) 및 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게). 기금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
