Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino
Summary
El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.
Abstract
Se ha demostrado que los macrófagos cardíacos residentes facilitan la conducción eléctrica en el corazón. El ritmo cardíaco fisiológico se inicia por impulsos eléctricos generados en el nódulo sinoauricular (SAN) y luego se conducen a los ventrículos a través del nódulo auriculoventricular (AVN). Para estudiar más a fondo el papel de los macrófagos residentes en el sistema de conducción cardíaca, es necesario un aislamiento adecuado de los macrófagos residentes de SAN y AVN, pero sigue siendo un desafío. Aquí, proporcionamos un protocolo para la microdisección confiable de la RAS y AVN en corazones murinos seguido del aislamiento y cultivo de macrófagos residentes.
Tanto el SAN que se encuentra en la unión de la crista terminalis con la vena cava superior, como AVN, que se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, están identificados y microdisecados. La localización correcta se confirma mediante el análisis histológico del tejido realizado con tinción tricrómica de Masson y por anti-HCN4.
Los tejidos microdisecados se digieren enzimáticamente para obtener suspensiones de células individuales seguidas de la incubación con un panel específico de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos de tipo celular. Esto permite identificar, contar o aislar diferentes poblaciones celulares mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Para diferenciar los macrófagos residentes cardíacos de otras células inmunes en el miocardio, especialmente los macrófagos derivados de monocitos reclutados, se necesita una estrategia de activación delicada diseñada. Primero, las células de linaje linfoide se detectan y se excluyen de un análisis adicional. Luego, las células mieloides se identifican con macrófagos residentes que se determinan por la alta expresión de CD45 y CD11b, y la baja expresión de Ly6C. Con la clasificación celular, los macrófagos cardíacos aislados se pueden cultivar in vitro durante varios días para una mayor investigación. Por lo tanto, describimos un protocolo para aislar macrófagos residentes cardíacos ubicados dentro del sistema de conducción cardíaca. Discutimos las trampas en la microdisección y digestión de SAN y AVN, y proporcionamos una estrategia de compuerta para identificar, contar y clasificar de manera confiable los macrófagos cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.
Introduction
El nódulo sinoauricular (SAN) inicia fisiológicamente el impulso eléctrico y, por lo tanto, es el marcapasos primario del corazón. El nódulo auriculoventricular (AVN) conduce el impulso eléctrico desde las aurículas hasta los ventrículos y también actúa como un marcapasos subsidiario1. En general, la generación y conducción de impulsos eléctricos es un proceso complejo que puede ser modulado por varios factores2, incluyendo macrófagos residentes en regiones SAN/AVN. Un estudio reciente de Hulsmans et al. demuestra una población específica de macrófagos cardíacos residentes que se enriquecen en la AVN y funcionan como actores clave para mantener un latido cardíaco constante3. Encontraron que los macrófagos están acoplados eléctricamente a los cardiomiocitos y podrían cambiar las propiedades eléctricas de los cardiomiocitos acoplados. Los autores también señalan que tales células conductoras que se entrelazan con los macrófagos también están presentes en otros componentes del sistema de conducción cardíaca, como el SAN.
Actualmente, no se sabe completamente si el fenotipo de los macrófagos cardíacos residentes difiere entre las regiones cardíacas. Sin embargo, se ha demostrado que el microambiente tisular puede afectar la transcripción y renovación proliferativa de los macrófagos tisulares4. Además, dado que se ha demostrado que el fenotipo de los cardiomiocitos es diferente entre regiones, los efectos funcionales de los macrófagos sobre los cardiomiocitos también pueden ser específicos de la región, incluso si el fenotipo de macrófagos en sí puede ser el mismo. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre regiones cardíacas específicas.
Estudios recientes han demostrado que, en estado estacionario, los macrófagos residentes en el tejido se establecen prenatalmente, surgiendo independientemente de la hematopoyesis definitiva, y persisten en la edad adulta5. Sin embargo, después del agotamiento de macrófagos o durante la inflamación cardíaca, los monocitosLy6c hi contribuyen a reponer la población de macrófagos cardíacos6. Los estudios que involucran el rastreo genético del linaje, la parabiosis, el mapeo del destino y el seguimiento celular mostraron la coexistencia de una variedad de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos en órganos y tejidos, y, también, diferentes comportamientos celulares de subconjuntos de macrófagos que están potencialmente asociados con su ontogenia 7,8,9.
La caracterización de macrófagos cardíacos residentes se ha beneficiado del uso de la clasificación de células activadas magnéticas (MACS) y la clasificación de células activadas fluorescentes. Estos métodos son particularmente útiles para aislar poblaciones celulares específicas de múltiples fracciones de tejido al etiquetarlas con sus marcadores de superficie celular. Esto no solo conduce a una mayor pureza del tipo de célula inmune aislada, sino que también permite el análisis fenotípico. Aquí, presentamos un protocolo que incluye células recubiertas de perlas magnéticas seguidas de clasificación de células activadas fluorescentes para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente aislados de la región SAN y AVN.
Para explorar las características de los macrófagos residentes cardíacos en el sistema de conducción y su función para la conducción cardíaca y la arritmogénesis, la localización y disección precisas de SAN y AVN son críticas. Para la microdisección de SAN y AVN, se utilizan puntos de referencia anatómicos para la identificación de la región10. En resumen, SAN se encuentra en la unión de la vena cava superior y la aurícula derecha. AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch, que está bordeado anteriormente por la valva septal de la válvula tricúspide, y posteriormente por el tendón de Todaro11. También proporcionamos un procedimiento preciso de microdisección de SAN y AVN en ratones que se confirma mediante histología y tinción de inmunofluorescencia.
Los macrófagos residentes aislados podrían usarse para experimentos adicionales, como la secuenciación de ARN, o podrían recuperarse y cultivarse durante más de dos semanas, lo que permitiría varios experimentos in vitro. Por lo tanto, nuestro protocolo describe un procedimiento muy valioso para el inmunorritmo. La Tabla 1 muestra la composición de todas las soluciones necesarias, la Figura 1 muestra los puntos de referencia de microdisección para SAN y AVN. La Figura 2 es una ilustración esquemática de la localización de SAN y AVN. La Figura 3 muestra la tinción histológica de SAN y AVN (tinción tricrómica e inmunofluorescencia de Masson). La Figura 4 muestra una estrategia de activación paso a paso para aislar macrófagos residentes cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, describimos un protocolo para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de las regiones SAN y AVN a alta pureza.
Los macrófagos se dividen en subpoblaciones en función de su ubicación anatómica y fenotipo funcional. También pueden cambiar de un fenotipo funcional a otro en respuesta a señales microambientales variables13. En comparación con otros órganos como la médula ósea y el hígado, el tejido cardíaco co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a S. Massberg), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
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