Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Burada sunulan protokol, kardiyak yerleşik makrofajların fare kalplerinin sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyoventriküler düğüm (AVN) bölgesinden izolasyonu için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.
Abstract
Yerleşik kardiyak makrofajların kalpteki elektriksel iletimi kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Fizyolojik kalp ritmi, sinoatriyal düğümde (SAN) üretilen elektriksel uyarılarla başlatılır ve daha sonra atriyoventriküler düğüm (AVN) yoluyla ventriküllere iletilir. Yerleşik makrofajların kardiyak iletim sistemindeki rolünü daha fazla incelemek için, yerleşik makrofajların SAN ve AVN’den uygun bir şekilde izole edilmesi gereklidir, ancak bu zor olmaya devam etmektedir. Burada, murin kalplerde SAN ve AVN’nin güvenilir mikrodiseksiyonu ve ardından yerleşik makrofajların izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz.
Hem crista terminalis’in superior vena kava ile kesiştiği noktada bulunan SAN hem de Koch üçgeninin tepesinde bulunan AVN tanımlanarak mikrodiseke edilir. Doğru yer, Masson trikrom boyası ve anti-HCN4 ile yapılan dokunun histolojik analizi ile doğrulanır.
Mikrodisseke edilmiş dokular daha sonra tek hücre süspansiyonları elde etmek için enzimatik olarak sindirilir ve ardından hücre tipi spesifik yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş spesifik bir antikor paneli ile inkübasyon yapılır. Bu, floresan aktif hücre sıralama ile farklı hücre popülasyonlarını tanımlamaya, saymaya veya izole etmeye izin verir. Kardiyak yerleşik makrofajları miyokarddaki diğer bağışıklık hücrelerinden, özellikle de işe alınan monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt etmek için, hassas bir şekilde tasarlanmış bir geçit stratejisine ihtiyaç vardır. İlk olarak, lenfoid soy hücreleri tespit edilir ve daha ileri analizlerden çıkarılır. Daha sonra, miyeloid hücreler, hem CD45 hem de CD11b’nin yüksek ekspresyonu ve Ly6C’nin düşük ekspresyonu ile belirlenen yerleşik makrofajlarla tanımlanır. Hücre sıralama ile, izole kardiyak makrofajlar daha sonra daha fazla araştırma için birkaç gün içinde in vitro olarak yetiştirilebilir. Bu nedenle, kardiyak iletim sistemi içinde bulunan kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için bir protokol tanımlıyoruz. SAN ve AVN’nin mikrodiseksiyonu ve sindirimindeki tuzakları tartışıyoruz ve floresan ile aktive olmuş hücre sıralama ile kardiyak makrofajları güvenilir bir şekilde tanımlamak, saymak ve sıralamak için bir geçit stratejisi sunuyoruz.
Introduction
Sinoatriyal düğüm (SAN) fizyolojik olarak elektriksel dürtüyü başlatır ve bu nedenle kalbin birincil kalp pilidir. Atriyoventriküler düğüm (AVN), elektriksel impulsu atriyumdan ventriküllere iletir ve ayrıca yardımcı bir kalp pili1 görevi görür. Genel olarak, elektriksel impulsların üretimi ve iletimi, SAN / AVN bölgelerindeki yerleşik makrofaj da dahil olmak üzere çeşitli faktörler2 tarafından modüle edilebilen karmaşık bir süreçtir. Hulsmans ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışma, AVN’de zenginleştirilmiş ve sabit bir kalp atışı3’ü tutmada kilit oyuncular olarak işlev gören belirli bir kardiyak yerleşik makrofajlar popülasyonunu göstermektedir. Makrofajların elektriksel olarak kardiyomiyositlere bağlandığını ve kuplajlı kardiyomiyositlerin elektriksel özelliklerini değiştirebileceğini bulmuşlardır. Yazarlar ayrıca, makrofajlarla iç içe geçen bu tür iletken hücrelerin, SAN gibi kardiyak iletim sisteminin diğer bileşenlerinde de bulunduğunu belirtmektedir.
Şu anda, yerleşik kardiyak makrofajların fenotipinin kardiyak bölgeler arasında farklılık gösterip göstermediği tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte, doku mikroçevresinin doku makrofajlarının transkripsiyonunu ve proliferatif yenilenmesini etkileyebileceği gösterilmiştir4. Ayrıca, kardiyomiyosit fenotipinin bölgeler arasında farklı olduğu gösterildiğinden, makrofajların kardiyomiyositler üzerindeki fonksiyonel etkileri, makrofaj fenotipinin kendisi aynı olsa bile, bölgeye özgü olabilir. Bu nedenle, belirli kardiyak bölgeler üzerinde daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kararlı durumda, dokuda yerleşik makrofajların prenatal olarak kurulduğunu, kesin hematopoezden bağımsız olarak ortaya çıktığını ve yetişkinliğe kadar devam ettiğini göstermiştir5. Bununla birlikte, makrofaj tükenmesinden sonra veya kardiyak inflamasyon sırasında, Ly6chi monositleri kardiyak makrofaj popülasyonunun yenilenmesine katkıda bulunur6. Genetik soy izleme, parabiyoz, kader haritalama ve hücre izlemeyi içeren çalışmalar, organ ve dokularda çeşitli doku yerleşik makrofaj popülasyonlarının bir arada bulunduğunu ve ayrıca ontojeni 7,8,9 ile potansiyel olarak ilişkili makrofaj alt kümelerinin farklı hücresel davranışlarını göstermiştir.
Yerleşik kardiyak makrofajların karakterizasyonu, manyetik aktif hücre sıralama (MACS) ve floresan aktif hücre sıralama kullanımından yararlanmıştır. Bu yöntemler, spesifik hücre popülasyonlarını, hücre yüzey belirteçleriyle etiketleyerek çoklu doku fraksiyonlarından izole etmek için özellikle yararlıdır. Bu sadece izole edilmiş bağışıklık hücresi tipinin daha yüksek saflığına yol açmakla kalmaz, aynı zamanda fenotipik analize de izin verir. Burada, manyetik boncuk kaplı hücreleri içeren bir protokol ve ardından SAN ve AVN bölgesinden özel olarak izole edilen kardiyak yerleşik makrofajların zenginleştirilmesi için floresan aktif hücre ayıklama ile birlikte sunulmaktadır.
İletim sistemindeki kardiyak yerleşik makrofajların özelliklerini ve kardiyak iletim ve aritmiyogenez fonksiyonlarını araştırmak için, SAN ve AVN’nin kesin lokalizasyonu ve diseksiyonu kritik öneme sahiptir. SAN ve AVN’nin mikrodiseksiyonu için, bölge tanımlaması için anatomik işaretler kullanılır10. Kısacası SAN, superior vena kava ile sağ atriyumun birleştiği noktada yer almaktadır. AVN, triküspid kapağın septal broşürü ve arkadan Todaro11’in tendonu ile ön sınırlanan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Ayrıca farelerde SAN ve AVN’nin histoloji ve immünofloresan boyama ile doğrulanan doğru bir mikrodiseksiyon prosedürünü de sağlıyoruz.
İzole edilmiş yerleşik makrofajlar, RNA dizilimi gibi daha ileri deneyler için kullanılabilir veya çeşitli in vitro deneylere izin vererek iki haftadan fazla bir süre boyunca geri kazanılabilir ve yetiştirilebilir. Bu nedenle, protokolümüz immüno-ritmolog için oldukça değerli bir prosedürü tanımlamaktadır. Tablo 1, ihtiyaç duyulan tüm çözümlerin bileşimini gösterir, Şekil 1 , SAN ve AVN için mikrodiseksiyon işaretlerini gösterir. Şekil 3 , SAN ve AVN’nin histolojik boyanmasını göstermektedir (Masson’un trikrom ve immünofloresan boyaması). Şekil 4 , floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için adım adım bir geçit stratejisi göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgelerinden yüksek saflıkta zenginleştirilmesi için bir protokol anlatılmaktadır.
Makrofajlar anatomik konumlarına ve fonksiyonel fenotiplerine göre alt popülasyonlara ayrılırlar. Ayrıca, değişken mikroçevresel sinyallere yanıt olarak bir fonksiyonel fenotipten diğerine geçebilirler13. Kemik iliği ve karaciğer gibi diğer organlarla karşılaştırıldığında, kalp dokusu daha d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia’ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255’ten S. Clauss’a, 81Z0600206’dan S. Kääb’a, 81Z0600204’ten C.S.’ye), Corona Vakfı (S199/10079/2019’dan S. Clauss’a), SFB 914 (Z01’den S. Massberg’e), Kardiyovasküler Hastalıklar Üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910’dan S. Clauss’a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss’a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
