Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van het syndroom van Turner (45XO) foetale cellen voor downstream modellering van neurologische tekorten geassocieerd met het syndroom

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft het genereren van integratievrije iPSC's uit foetale weefselfibroblasten door toediening van episomale plasmiden door nucleofection gevolgd door een beschrijving van methoden die worden gebruikt voor iPSC-karakterisering en neuronale differentiatie.

Abstract

Chromosomale aneuploïden veroorzaken ernstige aangeboren misvormingen, waaronder misvormingen van het centrale zenuwstelsel en foetale sterfte. Prenatale genetische screening is puur diagnostisch en verheldert het ziektemechanisme niet. Hoewel cellen van aneuploïde foetussen waardevol biologisch materiaal zijn met de chromosomale aneuploïdie, zijn deze cellen van korte duur, waardoor hun gebruik voor downstream onderzoeksexperimenten wordt beperkt. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) modellen is een effectieve methode van celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van aneuploïde eigenschappen. Ze zijn zelfvernieuwend en differentiëren in gespecialiseerde cellen die doen denken aan de embryonale ontwikkeling. IPSC's dienen dus als uitstekende hulpmiddelen om vroege ontwikkelingsgebeurtenissen te bestuderen. Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening geassocieerd met een geheel of gedeeltelijk ontbrekend X-chromosoom. Het syndroom wordt gekenmerkt door onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene, metabole, auto-immuun- en cardiovasculaire aandoeningen en neurocognitieve defecten. Het volgende protocol beschrijft isolatie en kweek van fibroblasten uit TS (45XO) foetaal weefsel, generatie van integratievrije TSiPSCs door levering van episomale herprogrammeringsplasmiden door nucleofection gevolgd door karakterisering. De herprogrammering van TSiPSC's werden aanvankelijk gescreend door levende cel alkalische fosfatasekleuring gevolgd door uitgebreid onderzoek naar pluripotentie biomarkers. Geselecteerde kolonies werden mechanisch ontleed, meerdere keren gepasseerd en stabiele zelfvernieuwende cellen werden gebruikt voor verdere experimenten. De cellen drukten pluripotentietranscriptiefactoren OCT4, NANOG, SOX2, celoppervlakmarkers SSEA 4 en TRA1-81 uit, typisch voor pluripotente stamcellen. Het oorspronkelijke 45XO karyotype bleef na herprogrammering behouden. De TSiPSCs waren in staat om embryoïde lichamen te vormen en te differentiëren in cellen van endoderm, mesoderm en ectoderm die afstammingsspecifieke biomarkers tot expressie brengen ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De exogene episomale plasmiden gingen spontaan verloren en werden na passage 15 in cellen niet gedetecteerd. Deze TSiPSC's zijn een waardevolle cellulaire bron voor het modelleren van defecte moleculaire en cellulaire neurologische ontwikkeling die neurocognitieve tekorten veroorzaakt die verband houden met het syndroom van Turner.

Introduction

Aneuploïdieën leiden tot aangeboren afwijkingen/aangeboren misvormingen en zwangerschapsverlies bij de mens. ~50%-70% van de monsters van zwangerschapsverliezen vertonen cytogenetische afwijkingen. Aneuploïde embryo's die vroeg in de zwangerschap verloren zijn gegaan, kunnen niet gemakkelijk worden verkregen voor experimentele analyse, waardoor de noodzaak ontstaat om andere modellen te ontwikkelen die de menselijke embryogenese nauw weergeven. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) afgeleid van cellen met de diagnose genetische aandoeningen zijn gebruikt om de representatieve genetische onregelmatigheden en hun gevolgen voor de foetale ontwikkeling te modelleren1,2,3,4. Deze iPSC's lijken op epiblastcellen van het zich ontwikkelende embryo en kunnen de vroege gebeurtenissen van embryovorming samenvatten. Ze maken begrip en karakterisering van het ontwikkelingsprogramma van cellijningen en patronen in vroege zoogdierembryo's mogelijk. iPSC's die eerder zijn afgeleid van huidfibroblasten en amniocyten van prenatale diagnostische tests van aneuploïdiesyndromen zoals monosomie X (syndroom van Turner), trisomie 8 (Syndroom van Warkany 2), trisomie 13 (Syndroom van Patau) en partiële trisomie 11; 22 (Emanuel syndroom) hebben waardevolle inzichten opgeleverd met betrekking tot mislukte ontwikkeling4.

Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening die wordt gekenmerkt door vrouwelijke onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene en metabole stoornissen, een verhoogd risico op auto-immuunziekten en een aanleg voor hart- en vaatziekten5. Hoewel het het enige overlevingswaardige monosomiesyndroom is, is het ook dodelijk voor het zich ontwikkelende embryo dat spontane abortussen veroorzaakt6. Overlevende individuen met TS presenteren zich met graden van verandering van X-chromosomaal materiaal in hun cellen. Karyotypen variëren van volledig verlies van één X-chromosoom (45,XO) tot mozaïeken zoals 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, de aanwezigheid van ringchromosomen, de aanwezigheid van Y-chromosomaal materiaal,enz. 5.

Diagnose van het syndroom wordt over het algemeen gedaan door karyotypering van bloed van symptomatische personen en chorion villi sampling (CVS) om vroege aneuploïdie syndromen te detecteren. Aangezien aneuploïdiesyndromen verantwoordelijk zijn voor ~ 30% van de spontane abortussen, is het routine om het product van conceptie (POC) bij een spontane abortus te karyotyperen. Deze foetale cellen, waaronder de chorionvilli die de cytogenetische afwijking bezitten en daarvan afgeleide iPSC's, bieden een waardevolle bron van biologisch materiaal om aneuploïdiesyndromen te bestuderen4,6. TS iPSC's zijn eerder vastgesteld uit amniocyten via retrovirale herprogrammering4, fibroblasten van chorionvlokken (verkregen door prenatale diagnose) via retrovirale herprogrammering6, uit mononucleaire bloedcellen7 via sendaivirusherprogrammering en uit huidfibroblasten van TS-individuen via lentivirale herprogrammering4 . Omdat de primaire focus van ons lab is om ontwikkelingsfalen te begrijpen, hebben we TS iPSC's gegenereerd uit POC, met name de chorionvilli-component van een spontane abortus8. Alle cellen geïsoleerd uit dit foetale weefsel hadden een 45XO karyotype en leverden iPSC's op met hetzelfde karyotype. Deze iPSC's zijn uniek omdat ze de eerste zijn die worden gegenereerd uit een geaborteerde foetus en een waardevolle bron bieden om aneuploïdiegerelateerde zwangerschapsfalen te bestuderen. Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie van het genereren van iPSC's uit deze unieke celbron via episomale herprogrammering.

De vroege methoden van iPSC-generatie gebruikten virale transductie en transposons om de herprogrammeringsfactoren te leveren. Methoden voor het induceren van cellen tot pluripotentie zijn geëvolueerd van het gebruik van integrerende retrovirale vectoren9, excisable lentiviral vectoren10,11 en transposon-gebaseerde methoden12 tot niet-integrerende adenovirale vectoren13 en Sendai virus gebaseerde vectoren14. Retrovirale en lentivirale herprogrammering, hoewel efficiënt, omvat integratie van de herprogrammeringsfactoren in de gastheerchromosomen, waardoor insertiemutaties ontstaan die onvoorziene effecten hebben in de iPSC's. Bovendien voorkomt virale herprogrammering translationele toepassing van iPSC's. RNA-gebaseerde systemen15 en directe eiwitafgifte16 zijn onderzocht om de potentiële risico's in verband met het gebruik van virussen en DNA-transfecties volledig te elimineren. Deze methoden zijn echter inefficiënt gebleken.

In 2011 rapporteerden Okita et al. een verbeterde efficiëntie van herprogrammering door episomale plasmiden aangevuld met TP53-onderdrukking via shRNA. Ze vervingen ook cMYC door niet-transformerende LMYC (kleincellig longcarcinoom geassocieerde MYC) om de veiligheid van de hiPSC's te verbeteren. Deze episomale plasmiden drukken 5 herprogrammeringsfactoren uit: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC en shRNA voor TP5317,18. Deze vectoren worden extra-chromosomaal gehandhaafd en gaan verloren uit de geherprogrammeerde cellen bij continue kweek, waardoor de lijnen transgeenvrij worden binnen 10-15 passages. Nucleofection is een gespecialiseerde vorm van elektroporatie die nucleïnezuren rechtstreeks in de kern van gastheercellen aflevert. Het is een efficiënte methode voor de toediening van de herprogrammeringsplasmiden in verschillende celtypen. Episomale plasmiden zijn kosteneffectief en compenseren de hoge kosten van nucleofection. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar onder geoptimaliseerde omstandigheden en levert stabiele iPSC's op uit een verscheidenheid aan somatische cellen. In dit protocol beschrijven we de methode voor het genereren van iPSC's uit fibroblasten geïsoleerd uit foetaal weefsel door nucleofection van episomale herprogrammeringsplasmiden. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor fibroblastisolatie van foetale chorionvilli, plasmidezuivering, nucleofection, plukken van kolonies uit de herprogrammeringsplaat en vaststelling van stabiele iPSC's.

Het is essentieel om de aanwezigheid van pluripotentiekenmerken in de nieuw gegenereerde iPSC's te bevestigen. Dit omvat het aantonen van pluripotentiegerelateerde factoren (bijv. alkalische fosfatase-expressie, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherine; meestal aangetoond met immunofluorescentie- of genexpressietests), identificatie van de drie kiemlagen door in vitro differentiatietests om hun differentiatiepotentiaal te valideren, karyotypering om het chromosomale gehalte te bepalen, STR-typering om identiteit met oudercellen vast te stellen, verlies van exogene genen te verifiëren, en strengere in vivo testen zoals teratoomvorming en tetraploïde complementatie. Hier beschrijven we karakteriseringsprotocollen van karyotypering, alkalische fosfatasekleuring van levende cellen, detectie van pluripotentiegerelateerde biomarkers door immunofluorescentie, in vitro differentiatietests en methode om verlies van exogene genen aan te tonen19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FCV werden verkregen van Manipal Hospital, Bengaluru, onder goedkeuring van de ethische commissie van Manipal Hospitals.

OPMERKING: Zie tabel 1 voor de samenstelling van alle buffers en oplossingen.

1. Isolatie van fibroblasten van foetale chorionvlokken (FCV)

  1. Monsterverzameling en weefseldesintegratie in collagenase
    1. Fcv verzamelen onder steriele omstandigheden in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en transporteren (bij kamertemperatuur) naar de celkweekfaciliteit.
    2. Breng de villi over in een petrischaaltje van 60 mm en was meerdere keren (minimaal 4 keer) in PBS met 1x Antibiotic Antimycotic solution (PBS-AA). Verwijder PBS-AA volledig door te pipetteren.
    3. Behandel de chorionvilli met 1 ml collagenasemengsel (5 mg/ml) gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    4. Neutraliseer met celkweekmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat, breng de digest over naar een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g om de gedesintegreerde villi en vrijgegeven cellen als een pellet te verzamelen.
  2. Subcultuur en voorraaduitbreiding
    1. Plaat gedesintegreerde villi samen met vrijgekomen cellen in een T25-kweekkolf met 5 ml volledige media (bijv. AmnioMAX) en groeien tot een confluente fibroblastcultuur is verkregen.
    2. Breid fibroblasten in cultuur uit om voorraden voor te bereiden voor gebruik in latere transfectie- en karakteriseringsexperimenten als volgt:
      1. Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe aan de T25-kolf met FCV-fibroblasten en incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 minuten om de cellen te dissociëren.
      2. Neutraliseer na incubatie trypsine door FBS toe te voegen (op hetzelfde volume als trypsine).
        OPMERKING: Kweekmedium dat FBS bevat, kan ook worden gebruikt om trypsine te neutraliseren, wanneer het wordt toegevoegd met een 1:3 trypsine:media ratio.
      3. Verzamel de gedissocieerde cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 225 x g om celpellets te verkrijgen.
      4. Decanteer supernatant en resuspend cell pellet in 1 ml complete media.
      5. Breng elk 500 μL over op 60 mm met weefselkweek behandelde schotels en maak het volume aan op 5 ml. Deze splitsingsverhouding van 1:2 werd ook gebruikt voor latere passages.
  3. Cryopreservatie
    1. Voer enzymatische dissociatie uit met behulp van 0,05% trypsine zoals beschreven in stappen 1.2.2.1 - 1.2.2.3 en verkrijg celpellets.
    2. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 1 ml vriesmengsel, bestaande uit 1:9 dimethylsulfoxide (DMSO): FBS.
    3. Breng de inhoud over naar een steriel cryoviaal en plaats de injectieflacon in een vriescontainer.
    4. Vries 's nachts in bij -80 °C en breng de injectieflacons de volgende dag over op vloeibare stikstof (-196 °C).

2. Plasmiden DNA Isolatie en verificatie

  1. Bacteriële celpreparaat
    1. Streak glycerol voorraden van E. coli die de drie afzonderlijke plasmiden pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK en pCXLE-hUL (van Addgene) bevatten op afzonderlijke Luria Bertani-ampicilline agarplaten.
    2. Ent enkele kolonies in startculturen van 5 ml Luria Bertani-ampicilline medium. Incubeer gedurende 8 uur bij 37 °C met schudden (10 x g).
    3. Ent 200 μL van deze startercultuur in 100 ml Luria Bertani-ampicillinemedium. Incubeer 's nachts bij 37 °C met schudden.
    4. Oogst 's nachts bacteriekweek door centrifugeren bij 6000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  2. Plasmide isolatie met Midi Plasmid zuiveringskit
    1. Resuspend bacteriële pellet in 4 ml resuspensiebuffer.
    2. Voeg 4 ml lysisbuffer toe en meng grondig door 4-6 keer krachtig om te keren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 4 ml voorgekoelde neutralisatiebuffer toe en keer de buis 4-6 keer om om grondig te mengen. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
    4. Centrifugeer bij ≥20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant in een verse buis en centrifugeer opnieuw bij ≥20.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    5. Breng de kolom in evenwicht door 4 ml equilibratiebuffer toe te passen.
    6. Pas het supernatant toe op de kolom.
    7. Was de kolom tweemaal met 10 ml wasbuffer.
    8. Elute DNA met 5 ml warme (65 °C) elutiebuffer.
    9. Precipiteer DNA door 3,5 ml isopropanol toe te voegen aan het geëlekte DNA. Meng goed. Centrifugeer bij ≥15.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Decanteer supernatant zorgvuldig.
    10. Was de DNA-pellet met 2 ml 70% ethanol en centrifugeer gedurende 10 minuten op ≥15.000 x g. Decanteer supernatant zorgvuldig.
    11. Droog de pellet aan de lucht gedurende 5-10 minuten en los DNA op in een geschikt volume water van PCR-kwaliteit om een eindconcentratie van 1 μg /ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Los DNA niet op in buffers omdat het niet geschikt is voor elektroporatie. Oude plasmide DNA-preparaten leveren geen geherprogrammeerde kolonies op.
  3. Plasmide verificatie door EcoRI restrictie vertering
    1. Combineer 15 μL nucleasevrij water, 2 μL 10x buffer, 1 μg plasmide DNA en 1 μL EcoRI enzym. Meng zachtjes.
    2. Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten in een warmteblok.
    3. Meng de verteerde plasmidemonsters met 6x DNA-gelbeladingskleurstof en elektroforese op 1% agarosegel in 1x TAE-buffer met 0,5 μg/ml ethidiumbromide. Inclusief standaard DNA-ladder. Stel de gel voor nadat het DNA op de juiste manier is opgelost. Verwachte EcoRI-bandmaten van pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F zijn 6.834 bp, 3.758 bp en 1.108 bp; pCXLE-hUL zijn 10.200 bp en 1.900 bp; pCXLE-hSK zijn 10.200 bp en 2.500 bp.

3. Nucleofection

  1. Cel pelleteren
    1. Kweek de geïsoleerde foetale villi fibroblasten in T25-kolf in 5 ml volledige media tot 80-90% confluentie.
    2. Was cellen tweemaal met PBS en trypsineer zoals beschreven in stappen 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Verwijder de supernatant, geresuspendeerde pellet in 5 ml gereduceerde serummedia (bijv. Opti-MEM). Tel cellen met hemocytometer en neem 106 cellen voor nucleofection. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min. Verwijder supernatant volledig.
  2. Reagenspreparaat en nucleofection
    1. Bereid nucleofectorreagens door 0,5 ml supplement en 2,25 ml nucleofectoroplossing (beide in de kit aanwezig) te mengen.
    2. Voeg 100 μL nucleofectoroplossing toe in een buis van 1,5 ml. Voeg 1μg elk van pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK en pCXLE-hUL toe aan de buis. Resuspend 106 cellen (vanaf stap 3.1.2) voorzichtig in deze mix.
    3. Breng de cel-DNA-suspensie over in cuvette en zorg ervoor dat het monster de bodem van de cuvette (meegeleverd in de kit) bedekt zonder luchtbellen. Sluit de cuvette af en steek deze in de houder. Selecteer het nucleofectorprogramma U-23 (voor hoge efficiëntie) en pas het toe.
    4. Verwijder cuvette uit de houder en voeg 1 ml complete media toe. Breng de inhoud voorzichtig over in een met weefselkweek behandelde petrischaal van 60 mm gevuld met 4 ml volledige media (tot een totaal van 5 ml media). Incubeer de cellen in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.
    5. Controleer na 24 uur of de cellen zich hebben gehecht. Vervang het medium volledig.
      OPMERKING: De snelheid van celdood is hoog in nucleofection waardoor er weinig levensvatbare cellen overblijven die zich hechten.
    6. Houd de cellen gedurende 10 dagen in volledige media en schakel de komende 20 dagen over op pluripotentiemedia.
      OPMERKING: Visualiseer cellen regelmatig om morfologische veranderingen te volgen die optreden in de herprogrammeringscellen (zoals epitheliale morfologie en compacte kolonievorming) om te bevestigen of het experiment werkt. Ongeveer 25 iPSC-kolonies zijn te zien na 20 dagen cultuur in pluripotentiemedia.

4. Plukken en vermeerderen van iPSC-kolonies

  1. Kolonie plukken van herprogrammeerplaat
    1. Ontleed handmatig de embryonale stamcelachtige kolonies die in de herprogrammeringsschaal zijn gevormd met behulp van getrokken glazen pipetten of spuitnaalden van 1 ml en breng over naar een eerder bereide plaat met geïnactiveerde embryonale fibroblastvoeders van muizen met pluripotentiemedium of breng feedervrije culturen tot stand op matrigel-gecoate platen met mTESR-medium.
      OPMERKING: Muisembryotische fibroblasten (MEF's) werden afgeleid met behulp van enzymatische isolatie van muizenembryo's (ontleed van 13-14 dagen zwangere vrouwelijke muizen) en werden mitotisch geïnactiveerd door mitomycine C-behandeling. Stel enkele kloonpopulaties in door enkele kolonies te laten groeien van herprogrammeerplaat in afzonderlijke schotels of gemengde kloonpopulaties door veel kolonies over te brengen van herprogrammeerplaat naar een enkele schaal.
  2. Mechanische overdracht van opkomende kolonies naar verse feeders en passaging om stabiele iPSC's te vestigen
    1. Vermeerder iPSC's in pluripotentiemedium door elke tweede dag te voeren en splits 1:3 om de 5-7 dagen. Bereid voorraden door cryopreserving in een vriesmix van KnockOut Serum Replacement en DMSO in de verhouding 9:1.
      OPMERKING: KnockOut Serum Replacement wordt gebruikt in de vriesmix voor cryopreservatie van iPSC's in plaats van FBS, omdat componenten in de FBS differentiatie van de pluripotente cellen kunnen induceren tijdens langdurige conservering.

5. Karakterisering van iPSC's

OPMERKING: Karakteriseringsstudies inclusief PCR en immunostaining voor pluripotentiebiomarker werden uitgevoerd na het vijfde passagenummer. Karyotypering werd uitgevoerd op een later passagenummer.

  1. Karyotypering
    1. Behandel een samenvloeiend petrischaaltje van 60 mm van iPSC's met colcemid gedurende 45 minuten in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.
    2. Oogst met 0,05% trypsine behandeling en centrifuge. Verwijder het supernatant en pipetteer de overgebleven sporen van medium om de celkorrel los te maken.
    3. Voeg 5 ml hypotone oplossing toe. Meng door de buis om te keren en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 min.
      OPMERKING: De verkregen pellet moet er luchtig uit zien.
    4. Voeg langzaam 2,5 ml Fixatieve oplossing van Carnoy toe terwijl u tikt om de pellet los te maken.
    5. Bereid spreads voor karyotypering voor door de celsuspensie op schone glasglaasjes te laten vallen.
    6. Behandel de dia's gedurende 1 minuut met 0,15% trypsine en was ze eenmaal met PBS. Vervolgens beitsen met Giemsa-oplossing gedurende 4 minuten en eindigen met een gedestilleerde waterwassing. Aanschaffen en verwerken met de juiste software.
  2. Bewijs van de transgene vrije status
    1. Genomische DNA-isolatie
      1. Pipetteer 20 μL protease in de bodem van een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      2. Voeg 200 μL TSiPSCs geresuspendeerd in PBS toe aan de microcentrifugebuis.
      3. Voeg 200 μL Buffer AL toe aan het monster en meng gedurende 15 s door puls-vortexing.
      4. Incubeer gedurende 10 min bij 56 °C.
      5. Centrifugeer de microcentrifugebuis kort om druppels van de binnenkant van het deksel te verwijderen.
      6. Voeg 200 μL ethanol (96-100%) toe aan het monster en meng opnieuw gedurende 15 s door pulsvortexing. Centrifugeer na het mengen kort de buis om druppels van de binnenkant van het deksel te verwijderen.
      7. Breng het mengsel uit de vorige stap voorzichtig aan op de mini-spinkolom (in een opvangbuis van 2 ml) zonder de rand nat te maken. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6000 x g. Gooi de buis met het filtraat weg en plaats de mini-spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml.
      8. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg zonder de rand nat te maken 500 μL Buffer AW1 toe. Sluit de dop en centrifugeer gedurende 1 min op 6000 x g. Plaats de mini-spinkolom in een schone opvangbuis van 2 ml en gooi de opvangbuis met het filtraat weg.
      9. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg 500 μL Buffer AW2 toe zonder de velg nat te maken. Sluit de dop en centrifugeer op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 minuten.
      10. Plaats de mini-spinkolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml en gooi de oude opvangbuis weg met het filtraat. Centrifugeer op volle snelheid gedurende 1 minuut om de kans op mogelijke buffer AW2-overdracht te elimineren.
      11. Plaats de mini-spinkolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en gooi de opvangbuis met het filtraat weg. Open voorzichtig de mini-spinkolom en voeg 200 μL buffer AE of gedestilleerd water toe. Incubeer bij kamertemperatuur (15-25 °C) gedurende 5 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 6000 x g.
    2. Transgene-Free Status PCR (met kapa hifi pcr kit kr0368)
      1. Zorg ervoor dat alle reagentia goed worden ontdooid en gemengd.
      2. Bereid een PCR-mastermix met het juiste volume van alle reactiecomponenten op basis van tabel 2 (stel reacties in op ijs).
      3. Breng de juiste volumes PCR-mastermix, sjabloon en primer over naar afzonderlijke PCR-buizen.
      4. Bep afzonderlijke reacties, meng en centrifugeer kort.
      5. Voer PCR uit volgens tabel 3.
  3. Pluripotentie biomarker identificatie
    1. Alkalische fosfatase (AP) kleuring
      1. Bereid een 1x AP live vlek werkoplossing door 3 μL 500x stockoplossing te verdunn in 1,5 ml DMEM/F-12 voor elke 10 cm2 kweekoppervlak.
      2. Verwijder het medium uit de iPSC kweekschaal. Was de kweek eenmaal met DMEM/F-12. Voeg de 1x AP live stain oplossing toe aan de iPSC's. Incubeer bij 37 °C gedurende 45 min.
      3. Verwijder de AP-vlek en was tweemaal met DMEM/F-12. Voeg verse DMEM /F-12 toe en beeld onder fluorescentiemicroscoop met behulp van een standaard FITC-filter binnen 30-90 minuten na kleuring.
    2. Immunostaining voor pluripotentie biomarkers
      1. Fixeer confluente iPSC-culturen met 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 °C. Was driemaal met PBS Tween 20 (PBST), elke was gedurende 5 minuten.
      2. Permeabiliseer de cellen met 0,3% Triton X-100 in PBST gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Driemaal wassen met PBST.
        OPMERKING: Permeabilisatie mag alleen worden uitgevoerd voor intracellulaire antigenen.
      3. Blokcellen met 3% runderserumalbumine (BSA) in PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de cellen 's nachts met primaire antilichamen (verdund 1:1000 in 1% BSA). Na primaire antilichaamincubatie, driemaal wassen met PBST.
      4. Incubateer cellen met het secundaire antilichaam (verdund 1:1000 in 1% BSA) gedurende 5 uur bij kamertemperatuur. Driemaal wassen met PBST.
      5. Label de kernen met 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 1 minuut. Was de cellen eenmaal met PBST.
      6. Leg beelden vast onder een fluorescerende microscoop.

6.In vitro differentiatietests

  1. Embryoïde Lichaam (EB) Differentiatie
    1. Snijd de iPSC-kolonies in kleine stukjes, verzamel en plaats in petrischalen met lage aanhechting in embryoïde lichaamsmedium. Laat de cellen 15 dagen groeien door het medium om de 3 dagen te vervangen.
      OPMERKING: De dag 15 EB's kunnen direct worden gebruikt voor de detectie van de drie kiemlaag biomarkers. Als alternatief kunnen specifieke celstammen worden geïnduceerd met groeifactoren, gevolgd door biomarkerdetectie.
  2. Endoderm (Hepatocyte) differentiatie
    1. Kweek de iPSC's in monolaagculturen in pluripotentiemedium.
    2. Eenmaal confluent, schakel over naar RPMI 1640 media met 1x insuline transferrine seleniet en 100 ng / ml activine A gedurende 2 dagen, gevolgd door groei in RPMI 1640 media met 30 ng / ml bFGF en 20 ng / ml BMP4 gedurende 9 dagen. Vervang medium om de 2 dagen.
    3. Vul vanaf dag 10 media aan met 0,1 μM dexamethason. Beëindig het experiment op dag 20.
  3. Mesoderm (Cardiomyocyte) differentiatie
    1. Plaat dag 8 EB's op 0,5% Matrigel-gecoate platen in embryoïde lichaamsmedium. Laat de EB's worden bevestigd en samenvouwen.
    2. Vul media aan met 20 ng / ml BMP4 en groei gedurende 20 dagen. Vervang medium elke 2-3 dagen. Beëindig het experiment op dag 20.
  4. Ectoderm (Neuronale) differentiatie
    1. Plaat dag 4 EB's op 2 μg/cm2 collageen type IV-gecoate platen in embryoïde lichaamsmedium. Laat de EB's worden bevestigd en samenvouwen.
    2. Verschuif de volgende dag medium naar DMEM F-12 met 2 mg / ml glucose, 1x insulinetransferrineseleniet en 2,5 μg / ml fibronectine. Beëindig het experiment op dag 15.
  5. Vorming van cerebrale organoïden
    1. Kweek TSiPSCs in een 35 mm weefselkweekschaal op MEF's tot 70-80% confluent. Snijd de kolonies en verzamel in een buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 225 x g. Gooi het supernatant weg.
    2. Was de stukjes kolonies door resuspending in 2 ml PBS en centrifugeer om het supernatant te verwijderen.
    3. Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe en tik op de buis om de cellen los te maken. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 3-4 minuten om de koloniestukken te dissociëren in een eencellige suspensie.
    4. Neutraliseer de trypsine door verdunning met 4 ml pluripotentiemedia die 10 μg /ml rho-geassocieerd eiwitkinase (ROCK) -remmer Y-27632 dihydrochloride (ROCKi) bevatten om dissociatie geïnduceerde celdood te voorkomen.
    5. Centrifugeer om een pellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 2 ml embryoïde lichaamsmedium met 10 μg / ml ROCKi.
    6. Verwijder 10 μL celsuspensie voor het tellen van cellen. Voeg 10 μL Trypan blue toe om dode cellen te detecteren. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    7. Voeg het juiste volume embryoïde lichaamsmedium met ROCKi toe aan de celsuspensie om 9.000 levende cellen per 150 μL te verkrijgen.
    8. Plaat 150 μL in elke put van een laag-aanbouwplaat met 96 putten en incubeer in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C. Controleer de platen na 24 uur op aggregatie. Verwijder op dag 2 voorzichtig het medium en vervang het door vers embryoïde medium zonder ROCKi.
    9. Breng op dag 6 EB's over naar putten van een laag aanbouwmiddel 24 putplaat met 500 μL neuraal inductiemedium bestaande uit DMEM-F12 met 1% N2-supplement, 2 mM GlutaMAX-supplement en 1 mM niet-essentiële aminozuren en 1 μg / ml heparine. Vervang het medium om de 2 dagen.
    10. Na 5 dagen in neuraal inductiemedium worden de neuro-epitheliale aggregaten in Matrigel ingesloten door een 2 cm x 2 cm vierkant parafilm over een lege tiplade van 200 μL-uiteinden te leggen. Druk parafilm met gehandschoende vingers over elk gaatje in de puntlade om kleine deukjes te maken. Reinig parafilm met 70% ethanol om te steriliseren.
    11. Breng het parafilm vierkant over in een schaal van 60 mm. Gebruik gesneden 200 μL tips om de neuro-epitheliale aggregaten over te brengen op de deuken in parafilm. Verwijder overtollig medium door te pipetteren.
    12. Voeg 30 μL ontdooide Matrigel toe aan de neuro-epithliale aggregaten en plaats het aggregaat in het midden van de Matrigel met behulp van een pipetpunt. Plaats de 60 mm schaal gedurende 20-30 minuten in een incubator van 37 °C om de Matrigel te polymeriseren.
    13. Voeg 5 ml cerebrale organoïde differentiatiemedium toe, bestaande uit 1:1 DMEM-F12: Neurobasaal medium, 0,5% N2-supplement, 2,5 μg / ml insuline, 2 mM GlutaMAX-supplement, 0,5 mM NEAA, 1% B27-supplement en 2,5 ml penicilline-streptomycine.
    14. Draai met een steriele tang het parafilmvel om en roer de schaal totdat de matrigel ingebedde aggregaten van het vel in het medium vallen. Kweek de ingebedde aggregaten in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C gedurende 4 dagen, waarbij de media op verschillende dagen worden ververst.
    15. Plaats na 4 dagen statische cultuur de 60 mm schotels op een orbitale shaker die in de incubator is geïnstalleerd en schudt bij 50 tpm. Kweek de organoïden gedurende 3 maanden en geef elke 3 dagen volledige mediaveranderingen met cerebrale organoïde differentiatiemedium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generatie van integratievrije iPSC's van een spontaan geaborteerde foetus met 45XO karyotype
We isoleerden fibroblasten uit FCV met een turnersyndroom (TS) specifiek 45XO karyotype en nucleofecteerden ze met episomale herprogrammeringsplasmiden om TSiPSCs te genereren die kunnen worden gebruikt voor downstream modellering van het syndroom, met name de geassocieerde neurologische tekorten (Figuur 1a&b). We gebruikten niet-integrerende episomale vectoren en nucleofection voor de transfectie-experimenten(figuur 1 c&d). We volgden morfologische veranderingen van cellen om het succes van herprogrammering te volgen. De verschuiving van de fibroblast naar epitheliale morfologie, gevolgd door een afgebakende compacte kolonievorming werd waargenomen (figuur 2a). TSiPSCs verwierven menselijke embryonale stamcelachtige morfologie met duidelijke randen en een hoge kern-tot-cytoplasmaverhouding rond dag 20 na transfectie(figuur 2b). Onvolledig geherprogrammeerde cellen krijgen daarentegen epitheliale morfologieën, maar slagen er niet in om compacte kolonies te vormen. (Figuur 2c).

Karakterisering van TSiPSCs
Karyotypering van TSiPSCs onthulde het 45XO karyotype geassocieerd met het syndroom van Turner(figuur 3a). Immunofluorescentie van TSiPSCs toonde expressie van pluripotentietranscriptiefactoren OCT4, NANOG, SOX2 en celoppervlakmarkers SSEA4, E-Cadherine en TRA-1-81. Menselijke embryonale stamcellen zijn de gouden standaard van pluripotente stamcellen. We voerden tegelijkertijd immunofluorescentie van HUES 1 uit, die werd gebruikt als positieve controle voor vergelijking van pluripotentie biomarkerexpressie door TSiPSC (Figuur 3b). Transgene vrije status van de TSiPSCs werd aangetoond door een genomische DNA PCR voor episomale plasmide markers OriP en EBNA. Door passage 15 gingen oripp en EBNA-gen verloren in de TSiPSCs.De episomale genen OriP en EBNA werden versterkt en vertoonden banden in passage 9 TSiPSCs die wijzen op de aanwezigheid van de episomale plasmiden in dit stadium. Deze genen werden echter niet versterkt in passage 15 TSiPSCs, wat wijst op een verlies van de episomale plasmiden en dus een transgene vrije toestand (figuur 3c).

In vitro differentiatie assays
Het differentiatiepotentieel van TSiPSC-lijnen werd in vitroaangetoond. TSiPSCs bij aggregatie in laagaanhechtingsplaten gevormde embryoïde lichamen (figuur 4a). Groeifactor geïnduceerde differentiatie van TSiPSCs werd gebruikt om celtypen van de drie kiemlagen te genereren. Immunofluorescentieanalyse met behulp van afstammingsspecifieke biomarkers bevestigde dat TSiPSC's differentieerden in representatieve derivaten van endoderm (SOX17), mesoderm (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β) en ectoderm (βIII TUBULIN) (Figuur 4b).

Cerebrale organoïde differentiatie.
TSiPSC's werden op een podiumgewijze manier gedifferentieerd als cerebrale organoïden. Eencellige suspensies van TSiPSCs werden geaggregeerd in embryoïde lichamen om de ontwikkeling van kiemlagen gedurende de eerste 6 dagen te stimuleren, gevolgd door inductie van neuro-epitheliale ontwikkeling gedurende 5 dagen. De neuro-epitheliale geaggregeerde waren ze ingebed in Matrigel die de extracellulaire matrix en keldermembraancomponenten leverden die de juiste apicobasale oriëntatie ondersteunen, uitgroei van neuro-epitheliale knoppen die uitzetten en lumen vormen. Immunofluorescentie met neuro-epitheliale marker NESTIN werd uitgevoerd om de algehele morfologie van de organoïden te observeren (figuur 5b). Het neuro-epitheel omringt een ventrikelachtige holte(figuur 5c - witte lijn). De organoïden vertonen morfologisch ventriculaire zones (VZ), subventrikelzone (SVZ) en cortexachtige gebieden(figuur 5c - respectievelijk rode, oranje en gele lijnen)

Figure 1
Figuur 1: Fibroblastisolatie en herprogrammering via nucleofection.  (a) Microscopisch beeld van foetale chorionvilli voorafgaand aan collagenasebehandeling. (b) Fibroblasten geïsoleerd uit foetale chorionvilli voor herprogrammeringsexperimenten. c)Controle van herprogrammeringsplasmiden door ecori-restrictievertering. d)Schematisch diagram van het transfectieprotocol dat wordt gebruikt voor iPSC-generatie uit foetale chorionfibrobroblasten met behulp van episomaal herprogrammeringsplasmiden via nucleofection. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vestiging van door het syndroom van Turner geïnduceerde pluripotente stamcellen. (a) Veranderingen in de celmorfologie waargenomen tijdens het verloop van de herprogrammering. b)Een volledig geherprogrammeerde TSiPSC-kolonie. (c) Een representatief beeld van een kolonie met onjuist geherprogrammeerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Karakterisering van TSiPSCs.  a)Karyotype van TSiPSCs. b)Immunofluorescentieanalyse van pluripotentiebiomarkers OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 en TRA-1-81 in TSiPSCs in vergelijking met embryonale stamcel HUES1. Kernen zijn gekleurd met 4', 6-diamidino-2-fenylindool. 3 quater. Demonstratie van de transgene vrije status van TSiPSCs. Lane 1- DNA ladder, Lane 2- OriP positieve controle met pCXLE-hSK, Lane 3- EBNA positieve controle met pCXLE-hSK, Lane 4-OriP met TSiPSCs, Lane 5-EBNA met TSiPSCs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: In vitro differentiatiepotentieel van TSiPSCs.  a)TSiPSC gedifferentieerd naar embryoïde lichamen. b)Immunofluorescentieanalyses van TSiPSCs voor endodermale marker SOX17, mesodermale marker myosine ventriculaire zware keten α/β en ectodermale markers βIII tubuline en SOX2. Kernen zijn gekleurd met 4', 6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Neuronale en cerebrale organoïde differentiatie van TSiPSCs.  (a)Om cytoarchitectuur van gedifferentieerde neuronen te begrijpen, werd falloïdinekleuring van Actine gedaan. TSiPSC-afgeleide neuronen vertoonden piramidaal gevormde neuronale soma (pijlpunt) met dendrieten en axonen (pijlen). Kernen zijn gekleurd met 4', 6-diamidino-2-fenylindool. Immunostaining. (a) Immunostaining voor Nestine en actine om de grove morfologie van de organoïden te observeren. (c) Kleuring voor Nestin om de apitisch en basaal georganiseerde neuronale lagen te visualiseren. Kernen zijn gekleurd met 4', 6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van media, buffers en oplossingen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: PCR Reaction Mix Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: PCR Cycling Program Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het genereren van stabiele cellulaire modellen van cytogenetisch abnormaal foetaal weefsel is noodzakelijk voor het bestendigen van een defect fenotype. De iPSC-route is de meest effectieve methode voor celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van defecte eigenschappen20.

Pluripotente stamcellen (PSC) vertonen eigenschappen van zelfvernieuwing en differentiatie in gespecialiseerde cellen die doen denken aan vroege splitsingsembryo's21. Vandaar dat PSC's kunnen dienen als uitstekende modellen om vroege moleculaire, cellulaire en ontwikkelingsdefecten bij voortijdig geaborteerde foetussen te bestuderen.

In dit artikel hebben we de menselijke iPSC-generatie beschreven met behulp van nucleofection in combinatie met de verbeterde episomale vectoren. De resultaten tonen aan dat deze combinatie een robuuste methode omvat voor het genereren van integratievrije menselijke iPSC-lijnen, zoals blijkt uit het feit dat afzonderlijke transfecties voldoende waren voor succesvolle herprogrammering. We volgden de progressieve omzetting van FCV-fibroblasten naar pluripotente cellen microscopisch. 20 dagen na transfectie zagen we kolonies van geherprogrammeerde TSiPSCs omringd met niet-geherprogrammeerde FCV fibroblasten. Morfologisch leken de afgeleide menselijke iPSC's op embryonale stamcellen die naast elkaar in het laboratorium waren gekweekt. Meestal worden de cellen samengevoegd als compacte kolonies met glanzende randen. De cellen van de kolonies hadden grote kernen en dicht opeengepakt, wat duidt op nauw membraancontact tussen de cellen. De niet-geherprogrammeerde fibroblasten boog en omringden deze kolonies. Na overdracht naar iMEF's blijven ze zich in cultuur verspreiden voor meer dan 30 overdrachten die de eigenschap van voortdurende zelfvernieuwing aantonen.

Omdat TSiPSCs werden gegenereerd uit 45XO fibroblasten, hebben we de cellen karyotypeerd om te controleren of ze de chromosomale samenstelling behielden. De TSiPSCs handhaafden het 45XO karyotype in celcontinucultuur, wat wijst op een stabiele genetische samenstelling van het 45XO-chromosoom. Om nuttig te zijn als cellulaire bron die 45XO-aneuploïdie vertegenwoordigt, moeten de TSiPSCs vrij zijn van exogene DNA die wordt gebruikt in de herprogrammeringsexperimenten. We controleerden de aanwezigheid van resterende episomale plasmiden door een genomische DNA PCR uit te voeren voor episomale specifieke markers-OriP en EBNA. We vonden geen spoor van deze markers in TSiPS-cellen na 15 passages die suggereren dat de TSiPSCs geleidelijk episomaal herprogrammeringsvectoren verloren in langdurige cultuur.

Het kenmerk van een pluripotente cel is het potentieel om te differentiëren naar cellen van drie geslachtslijn, zowel in vitro als in vivo. Om dit vermogen in de afgeleide TSiPSCs te testen, onderwierpen we ze in vitro aan embryoïde lichaamsvorming en differentiatietests gericht door afstamming die cytokines en groeifactoren specificeren. TSiPSCs vormden embryoïde lichamen en differentieerden in ectodermale cellen die neuronale markers tot expressie brengen, mesodermale cellen die cardiale markers tot expressie brengen en endodermale cellen die SOX17 tot expressie brengen, een biomarker van het lot van endoderm. We hebben ook het vermogen van TSiPSCs getest om te differentiëren in hogere orde 3D cerebrale organoïden met behulp van eerder vastgestelde protocollen22. TSiPSC's organiseren zichzelf geleidelijk dankzij hun eigen intrinsieke ontwikkelingsprogramma's in miniweefsels die organoïden worden genoemd. TSiPSCs leverden cerebrale organoïden op die een cytoarchitectuur vertoonden die vergelijkbaar was met hersenweefsel met neuro-epitheel rond een ventrikelachtige holte. Deze organoïden moeten echter verder uitgebreid worden gekarakteriseerd om de exacte celtypen te onthullen en vergeleken met normale iPSC's om de intrinsieke neurale weefselpatrooneigenschappen van TSiPSC's te onderscheiden. Deze cerebrale organoïden en andere soorten hersenorganoïden gegenereerd uit TSiPSCs kunnen worden gebruikt om ontwikkelings- en functionele inconsistenties te modelleren die kunnen bijdragen aan de symptomen van neurologische tekortkomingen van TS-individuen. TSiPSCs vertoonden biomarkerkenmerken van pluripotentie en het kenmerkende kenmerk van differentiatie, waardoor het succes van herprogrammering naar geïnduceerde pluripotentie werd benadrukt.

De hierboven beschreven methode heeft efficiënt gewerkt bij het herprogrammeren van dermale fibroblasten en mesenchymale cellen afgeleid van verschillende bronnen in ons laboratorium (gegevens van andere lijnen niet weergegeven). In onze ervaring zijn de volgende stappen van cruciaal belang voor het succes van het herprogrammeringsexperiment:

a) Kwaliteit van plasmidepreparaat: oude preparaten leveren geen IPSC's op.
b) Kwaliteit van cellen die worden gebruikt voor transfecties: prolifererende cellen zijn essentieel voor iPSC-generatie. 0,5 tot 1 miljoen cellen per transfectie leverden een reproduceerbare herprogrammeringsefficiëntie op.
c) Vers gereconstitueerde nucleofectorreagentia: gereconstitueerde nucleofectorreagentia die gedurende meer dan een maand waren opgeslagen, leverden geen iPSC's op.
d) Onderhoud van de mastercelbank door mechanische subcultuur van de iPSC's leverde stabiele lijnen op. Enzymatische dissociatie werd gebruikt volgens de experimentele vereisten.

Het toekomstige doel van het lab is om een panel van chromosomaal abnormale iPSC's op te zetten voor downstream ontwikkeling, functionele en ziektemodellering met behulp van deze efficiënte methode. Foetale aneuploïden veroorzaken zwangerschapsverlies en orgaanmisvormingen bij levendgeborenen. Aneuploïde iPSC's afgeleid van weefsels van spontane abortussen zijn een waardevolle bron om mislukte embryonale ontwikkelingsgebeurtenissen te modelleren en te bestuderen. In vitro 2D- en 3D-kweeksystemen, waaronder embryoïde lichamen en weefselspecifieke organoïden22, zullen onderzoekers in staat stellen moleculaire en cellulaire onregelmatigheden te begrijpen, zoals afwijkende celproliferatie en celdood in afstammingsspecifieke cellen die zich kunnen manifesteren als ontwikkelingsafwijkingen en zwangerschapsfalen geassocieerd met aneuploïdiesyndromen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiële steun voor het bovenstaande onderzoek werd verstrekt door Manipal Academy of Higher Education. De karakterisering van de lijn werd gedeeltelijk uitgevoerd in het laboratorium van M.M. Panicker bij NCBS. Wij danken Anand Diagnostic Laboratory voor hulp bij karyotypering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 178 Herprogrammering Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Aneuploïdieën Aangeboren misvormingen Spontane foetale dood Syndroom van Turner Neurologische tekorten
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van het syndroom van Turner (45XO) foetale cellen voor downstream modellering van neurologische tekorten geassocieerd met het syndroom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter