Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Turners syndrom (45XO) Fosterceller för nedströms modellering av neurologiska underskott i samband med syndromet

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver generering av integration gratis iPSCs från fetala vävnad fibroblaster genom leverans av episomal plasmider genom nukleofection följt av beskrivning av metoder som används för iPSC karakterisering och neuronal differentiering.

Abstract

Kromosomal aneuploidies orsaka allvarliga medfödda missbildningar inklusive centrala nervsystemet missbildningar och fetala död. Prenatala genetisk screening är rent diagnostisk och belyser inte sjukdom mekanism. Även om celler från aneuploida foster är värdefullt biologiskt material som bär kromosomal aneuploidy, är dessa celler kortlivade, vilket begränsar deras användning för nedströms forskningsexperiment. Generering av inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) är en effektiv metod för cellberedning för evig bevarande av aneuploidegenskaper. De är självförnyande och differentierar sig till specialiserade celler som påminner om embryonal utveckling. IPSCs fungerar således som utmärkta verktyg för att studera tidiga utvecklingshändelser. Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som är associerade med en helt eller delvis saknas X-kromosom. Syndromet kännetecknas av infertilitet, kort resning, endokrina, metabola, autoimmuna och kardiovaskulära störningar och neurokognitiva defekter. Följande protokoll beskriver isolering och odling av fibroblaster från TS (45XO) fetala vävnad, generering av integration gratis TSiPSCs genom leverans av episomal omprogrammering plasmider genom nukleofection följt av karakterisering. Omprogrammering TSiPSCs screenades ursprungligen av levande cell alkaliska fosfatas färgning följt av omfattande sondering för pluripotency biomarkörer. Utvalda kolonier dissekerades mekaniskt, passagedes flera gånger och stabila självförnyande celler användes för ytterligare experiment. Cellerna uttryckte pluripotency transkriptionsfaktorer OCT4, NANOG, SOX2, cellytan markörer SSEA 4 och TRA1-81 typiska för pluripotenta stamceller. Den ursprungliga 45XO karyotyp behölls efter omprogrammering. TSiPSCs kunde bilda embryoidkroppar och differentieras till celler av endoderm, mesoderm och ectoderm som uttrycker härstamningsspecifika biomarkörer ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Exogena episomal plasmids förlorades spontant och inte upptäckts efter passage 15 i celler. Dessa TSiPSCs är en värdefull cellulär resurs för modellering defekt molekylära och cellulära neuroutveckling orsakar neurokognitiva underskott är associerade med Turner syndrom.

Introduction

Aneuploidies leder till fosterskador/medfödda missbildningar och graviditet förlust hos människor. ~ 50%-70% av exemplaren från graviditetsförluster visar cytogenetiska avvikelser. Aneuploida embryon som förlorats tidigt i graviditeten kan inte lätt erhållas för experimentell analys som ökar behovet av att utveckla andra modeller som nära representerar human embryogenes. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som härrör från celler som diagnostiserats med genetiska störningar har använts för att modellera de representativa genetiska oegentligheterna och deras konsekvens på fostrets utveckling1,2,3,4. Dessa iPSCs liknar epiblastceller i det utvecklande embryot och kan rekapitulera de tidiga händelserna i embryobildning. De tillåter förståelse och karakterisering av utvecklingsprogrammet för cell härstamningar och mönstra i tidiga däggdjursembryon. IPSCs härrör tidigare från huden fibroblaster och amniocyter från prenatala diagnostiska tester av aneuploidy syndrom som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) och partiell trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har gett värdefulla insikter om misslyckad utveckling4.

Turner syndrom (TS) är ett sällsynt tillstånd som kännetecknas av kvinnlig infertilitet, kort resning, endokrina och metabola störningar, en ökad risk för autoimmun sjukdom och en predisposition för hjärt-kärlsjukdom5. Även om det är det enda överlevnadsbara monosomisyndromet är det också dödligt för det utvecklande embryot som orsakar spontana aborter6. Överlevande individer med TS närvarande med grader av förändring av X-kromosomal material i sina celler. Karyotyper varierar från fullständig förlust av en X-kromosom (45,XO) till mosaiker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, närvaron av ringkromosomer, närvaron av Y-kromosommaterialetc.

Diagnos av syndromet görs i allmänhet genom karyotypning blod av symptomatiska individer och chorionic villi provtagning (CVS) för att upptäcka tidiga aneuploidy syndrom. Eftersom aneuploidy syndrom står för ~ 30% av spontana aborter, är det rutin att karyotyp produkten av befruktning (POC) vid en spontan abort. Dessa fetala celler inklusive chorionic villi som har cytogenetiska onormala tillstånd och iPSCs som härrör från dem ger en värdefull källa till biologiskt material för att studera aneuploidy syndrom4,6. TS iPSCs har tidigare etablerats från amniocyter via retroviral omprogrammering4, fibroblaster av korioniska villi (erhållna genom prenatal diagnos) via retroviral omprogrammering6, från blodmononukleära celler7 via Sendai virus omprogrammering och från huden fibroblaster av TS-individer via lentiviral omprogrammering4 . Eftersom det primära fokuset för vårt labb är att förstå utvecklingsmisslyckande har vi genererat TS iPSCs från POC, särskilt den chorionic villi komponenten i en spontan abort8. Alla celler isolerade från denna fetala vävnad hade en 45XO karyotyp och gett iPSCs med samma karyotyp. Dessa iPSCs är unika eftersom de är de första som genereras från ett aborterat foster och ger en värdefull resurs för att studera aneuploidy relaterade graviditet misslyckanden. Den här artikeln innehåller en detaljerad metod för generering av iPSCs från denna unika cellkälla via episomal omprogrammering.

De tidiga metoderna för iPSC-generering använde viral transduktion och transposoner för att leverera omprogrammeringsfaktorerna. Metoder för att inducera celler till pluripotens har utvecklats från att använda integrera retrovirala vektorer9,excisable lentiviral vektorer10,11 och transposonbaserade metoder12 till icke-integrerande adenoviral vektorer13 och Sendai virusbaserade vektorer14. Retroviral och lentiviral baserade omprogrammering, även om effektiv, innebär integration av omprogrammeringsfaktorerna i värd kromosomer, orsakar insättning mutationer som har oförutsedda effekter i iPSCs. Dessutom förhindrar virusbaserad omprogrammering translationell tillämpning av iPSC. RNA-baserade system15 och direkt proteintillförsel16 har undersökts för att helt eliminera de potentiella riskerna i samband med användning av virus och DNA-transfektioner. Dessa metoder har dock visat sig ineffektiva.

Under 2011 rapporterade Okita et al. förbättrad effektivitet av omprogrammering av episomala plasmider förstärkta med TP53-dämpning via shRNA. De ersatte också cMYC med icke-transformerande LMYC (små cell lung carcinom associerade MYC) för att förbättra säkerheten för hiPSCs. Dessa episomala plasmider uttrycker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC och shRNA för TP5317,18. Dessa vektorer underhålls extra-kromosomalt och förloras från de omprogrammerade cellerna på kontinuerlig kultur, vilket gör linjerna transgene-fria inom 10-15 passager. Nukleofection är en specialiserad form av elektroporation som levererar nukleinsyror direkt in i kärnan av värdceller. Det är en effektiv metod för leverans av omprogrammeringsplasmider till olika celltyper. Episomala plasmider är kostnadseffektiva och kompenserar de höga kostnaderna för nukleofection. Denna metod är effektiv och reproducerbar under optimerade förhållanden som ger stabila iPSCs från en mängd olika somatiska celler. I detta protokoll beskriver vi metoden för generering av iPSCs från fibroblaster isolerade från fetala vävnad genom nukleofection av episomal omprogrammering plasmider. Här är de detaljerade protokollen för fibroblast isolering från fetala chorionic villi, plasmid rening, nukleofection, plockning av kolonier från omprogrammering plattan och upprättandet av stabila iPSCs.

Det är viktigt att bekräfta förekomsten av pluripotency egenskaper i de nyligen genererade iPSCs. Detta inkluderar påvisande av pluripotensrelaterade faktorer (t.ex. alkaliska fosfatasuttryck, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; vanligtvis visas med immunofluorescens- eller genuttrycksanalyser), identifiering av de tre bakterielagren genom in vitro-differentieringsanalyser för att validera deras differentieringspotential, karyotypning för att bestämma kromosominnehåll, STR-skrivning för att fastställa identitet med överordnade celler, verifiera förlust av gener. och strängare in vivo-analyser såsom teratombildning och tetraploidkomplementering. Här beskriver vi karakteriseringsprotokoll av karyotypning, levande celler alkalisk fosfatasfärgning, detektion av pluripotensrelaterade biomarkörer genom immunofluorescens, in vitro differentieringsanalyser och metod för att visa förlust av exogena gener19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FCV erhölls från Manipal Hospital, Bengaluru, under Etikkommittén för Manipal Hospitals godkännande.

SE tabell 1 för sammansättning av alla buffertar och lösningar.

1. Isolering av fibroblaster från fetala chorionic villi (FCV)

  1. Provsamling och vävnadsupplösning i kollagenas
    1. Samla FCV under sterila förhållanden i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och transportera (vid rumstemperatur) till cellodlingsanläggningen.
    2. Överför villi till en 60 mm Petriskål och tvätta flera gånger (minst 4 gånger) i PBS som innehåller 1x antimykotisk lösning (PBS-AA). Ta bort PBS-AA helt genom pipettering.
    3. Behandla chorionic villi med 1 mL kollagenasblandning (5 mg/ml) i 5 min vid 37 °C.
    4. Neutralisera med cellodlingsmedium som innehåller 10% fetalt bovinserum (FBS), överför sammandrag till ett 15 ml rör och centrifugera vid 225 x g i 5 minuter för att samla upp de sönderfallna villi och släppte celler som en pellet.
  2. Subkultur och aktieexpansion
    1. Plattan upplöstes villi tillsammans med frigjorda celler i en T25-odlingskolv som innehåller 5 ml komplett media (t.ex. AmnioMAX) och växer tills en sammanflöde fibroblastkultur erhålls.
    2. Expandera fibroblaster i kulturen för att förbereda lager för användning i efterföljande transfekterings- och karakteriseringsexperiment enligt följande:
      1. Tillsätt 2 ml 0,05 % trypsin i T25-kolven som innehåller FCV fibroblaster och inkubera vid 37 °C i 3-5 minuter för att dissociera cellerna.
      2. Efter inkubation neutraliserar du trypsin genom att tillsätta FBS (med samma volym som trypsin).
        OBS: Odlingsmedium som innehåller FBS kan också användas för att neutralisera trypsin, när det läggs till vid en 1: 3 trypsin: medieförhållande.
      3. Samla de dissocierade cellerna i ett 15 ml-rör och centrifugera vid 225 x g i 5 minuter för att erhålla cellpellet.
      4. Dekantera supernatant och resuspend cell pellet i 1 ml komplett media.
      5. Överför 500 μL vardera till 60 mm vävnadsodlingsbehandlade rätter och utgör volymen till 5 ml. Detta delningsförhållande på 1:2 användes också för efterföljande passager.
  3. Cryopreservation
    1. Utför enzymatisk dissociation med 0,05% trypsin enligt beskrivningen i steg 1.2.2.1 - 1.2.2.3 och erhåll cellpellet.
    2. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 1 ml frysblandning, bestående av 1:9 dimetylsulfoxid (DMSO): FBS.
    3. Överför innehållet till en steril kryovial och placera injektionsflaskan i en frysbehållare.
    4. Frys över natten vid -80 °C och överför sedan injektionsflaska till flytande kväve (-196 °C) nästa dag.

2. Plasmider DNA Isolering och verifiering

  1. Bakteriell cellberedning
    1. Strimmor av E. coli som innehåller de tre enskilda plasmiderna pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK och pCXLE-hUL (från Addgene) på separata Luria Bertani-ampicillin agarplattor.
    2. Inokulera enskilda kolonier i startkulturer på 5 ml Luria Bertani-ampicillin medium. Inkubera i 8 timmar vid 37 °C med skakningar (10 x g).
    3. Inokulera 200 μL av denna startkultur till 100 ml Luria Bertani-ampicillin medium. Inkubera över natten vid 37 °C med skakningar.
    4. Skörda bakteriekultur över natten genom centrifugering vid 6000 x g i 15 min vid 4 °C.
  2. Plasmidisolering med Midi Plasmid reningskit
    1. Resuspend bakteriell pellet i 4 mL resuspension buffert.
    2. Tillsätt 4 ml lysbuffert och blanda noggrant genom att kraftigt invertera 4-6 gånger och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
    3. Tillsätt 4 ml förkyld neutraliseringsbuffert och invertera röret 4-6 gånger för att blanda ordentligt. Inkubera på is i 15 min.
    4. Centrifug vid ≥20 000 x g i 30 min vid 4 °C. Samla supernatant i ett nytt rör och centrifugera om vid ≥20 000 x g i 15 min vid 4 °C.
    5. Balansera kolonnen genom att använda 4 ml jämviktsbuffert.
    6. Använd supernatanten på kolumnen.
    7. Tvätta kolonnen två gånger med 10 ml tvättbuffert.
    8. Elute DNA med 5 ml varm (65 °C) elutionsbuffert.
    9. Fäll ut DNA genom att tillsätta 3,5 ml isopropanol till det eliserade DNA: t. Blanda väl. Centrifug vid ≥15 000 x g i 30 min vid 4 °C. Dekantera supernatant försiktigt.
    10. Tvätta DNA-pelleten med 2 ml 70% etanol och centrifug vid ≥15 000 x g i 10 minuter. Dekantera supernatant försiktigt.
    11. Lufttorkad pellet i 5-10 min och lös upp DNA i en lämplig volym PCR-klass vatten för att erhålla en slutlig koncentration på 1 μg/ml.
      OBS: Lös inte upp DNA i buffertar eftersom det inte är lämpligt för elektroporation. Gammal plasmid DNA-beredning ger inte omprogrammerade kolonier.
  3. Plasmid verification av EcoRI begränsning matsmältning
    1. Kombinera 15 μL nukleasfritt vatten, 2 μL 10x buffert, 1 μg plasmid-DNA och 1 μL EcoRI-enzym. Blanda försiktigt.
    2. Inkubera blandningen vid 37 °C i 15 min i ett värmeblock.
    3. Blanda de smälta plasmidproverna med 6x DNA-gelladdningsfärg och elektrofores på 1% agarosgel i 1x TAE-buffert med 0,5 μg/ml etidiumbromid. Inkludera standard DNA-stege. Avbilda gelén efter att DNA:t har lösts på lämpligt sätt. Förväntade EcoRI-bandstorlekar på pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F är 6 834 bp, 3 758 bp och 1 108 bp; pCXLE-hUL är 10 200 bp och 1 900 bp; pCXLE-hSK är 10 200 bp och 2 500 bp.

3. Nukleofection

  1. Cellpellets
    1. Kultur isolerade fetala chorionic villi fibroblaster i T25 kolv i 5 ml komplett media till 80-90% confluency.
    2. Tvätta cellerna två gånger med PBS och prova enligt beskrivningen i steg 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Ta bort supernatanten, återanvänd pelleten i 5 ml reducerat serummedium (t.ex. Opti-MEM). Räkna celler med hemocytometer och ta 106 celler för nukleofection. Centrifug vid 225 x g i 5 min. Ta bort supernatanten helt.
  2. Reagensberedning och nukleofection
    1. Förbered nukleofektorreagens genom att blanda 0,5 ml tillägg och 2,25 ml nukleoflektorlösning (båda i satsen).
    2. Tillsätt 100 μL nukleofektorlösning i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 1 μg vardera pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK och pCXLE-hUL till röret. Använd försiktigt 106 celler (från steg 3.1.2) i denna blandning.
    3. Överför cell-DNA-suspensionen till cuvette, så att provet täcker botten av cuvettet (medföljer i satsen) utan luftbubblor. Kapa cuvettet och sätt in i hållaren. Välj nukleofectorprogram U-23 (för hög effektivitet) och ansök.
    4. Ta ut cuvette ur hållaren och tillsätt 1 ml komplett media. Överför innehållet försiktigt till en 60 mm vävnadskulturbehandlad Petri-skål fylld med 4 ml komplett media (till totalt 5 ml media). Inkubera cellerna i en fuktad CO2 inkubator vid 37 °C.
    5. Efter 24 timmar, kontrollera om cellerna har fästs. Byt ut mediet helt.
      OBS: Graden av celldöd är hög i nukleofection lämnar få livskraftiga celler som fäster.
    6. Underhåll cellerna i fullständigt medium i 10 dagar och skifta till pluripotency media under de kommande 20 dagarna.
      OBS: Visualisera celler regelbundet för att följa morfologiska förändringar som sker i omprogrammeringscellerna (som epitelmorfologi och kompakt kolonibildning) för att bekräfta om experimentet fungerar. Omkring 25 iPSC-kolonier kan ses efter 20 dagars kultur i pluripotency media.

4. Plockning och förökning av iPSC-kolonier

  1. Plocka koloni från omprogrammeringsplatta
    1. Dissekera manuellt de embryonala stamcellsliknande kolonierna som bildas i omprogrammeringsfatet med hjälp av pulled glass pipetter eller 1 mL spruta nålar och överför till tidigare beredda tallrik med inaktiverade mus embryonala fibroblastmatare med pluripotency medium eller upprätta matarfria kulturer på Matrigel belagda plattor med mTESR medium.
      OBS: Mus embryonala fibroblaster (MEFs) härleddes med enzymatiska isolering från musembryon (dissekerade från 13-14 dagar gravida kvinnliga möss) och inaktiverades mitotically av mitomycin C behandling. Etablera enstaka klonpopulationer genom att odla enstaka kolonier från omprogrammeringsplatta i separata rätter eller blandade klonpopulationer genom att överföra många kolonier från omprogrammeringsplatta till en enda maträtt.
  2. Mekanisk överföring av framväxande kolonier till färska matare och passaging för att etablera stabila iPSCs
    1. Sprid iPSCs i pluripotency medium genom att mata varannan dag och dela 1:3 var 5-7 dag. Förbered lager genom kryopreservering i en frysmix av KnockOut Serum Replacement och DMSO i förhållandet 9:1.
      OBS: KnockOut Serum Replacement används i frysblandningen för kryopreservation av iPSCs istället för FBS eftersom komponenter i FBS kan inducera differentiering av pluripotenta celler under långvarig konservering.

5. Karakterisering av iPSC

OBS: Karakteriseringsstudier inklusive PCR och immunstaining för pluripotency biomarkör gjordes efter det femte passagenumret. Karyotypning utfördes vid ett senare passagenummer.

  1. Karyotypning
    1. Behandla en sammanflöde 60 mm Petriskål av iPSCs med kolcemid i 45 min i fuktad CO2 inkubator vid 37 °C.
    2. Skörda med 0,05% trypsinbehandling och centrifug. Ta bort supernatanten och pipetten de överblivna spåren av medium för att lossa cellpelleten.
    3. Tillsätt 5 ml hypoton lösning. Blanda genom att vända röret och inkubera i 20 minuter vid 37 °C. Centrifug vid 225 x g i 5 min.
      OBS: Den erhållna pelleten ska verka fluffig.
    4. Tillsätt 2,5 ml av Carnoys fixativa lösning långsamt, samtidigt som du knackar för att lossa pelleten.
    5. Förbered pålägg för karyotypning genom att släppa cellfjädringen på rena glasrutschbanor.
    6. Behandla bilderna med 0,15% trypsin i 1 minut och tvätta en gång med PBS. Fläcka sedan med Giemsa-lösningen i 4 min och avsluta med en destillerad vattentvätt. Förvärva och bearbeta med lämplig programvara.
  2. Demonstration av transgenefri status
    1. Genomisk DNA-isolering
      1. Pipett 20 μL proteas i botten av ett 1,5 mL mikrocentrifugerör.
      2. Tillsätt 200 μL TSIPSCs som återanvänds i PBS till mikrocentrifugeröret.
      3. Tillsätt 200 μL buffert AL i provet och blanda i 15 s genom pulsvirvel.
      4. Inkubera i 10 min vid 56 °C.
      5. Centrifugera mikrocentrifugeröret kort för att ta bort droppar från lockets insida.
      6. Tillsätt 200 μL etanol (96-100%) till provet och blanda igen i 15 s genom att virvla. Efter blandning, centrifugera röret kort för att ta bort droppar från lockets insida.
      7. Applicera försiktigt blandningen från föregående steg på minispinnkolonnen (i ett 2 ml uppsamlingsrör) utan att väta kanten. Stäng locket och centrifugera vid 6000 x g i 1 min. Kassera röret som innehåller filtratet och placera minispinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör.
      8. Öppna försiktigt minispinnkolonnen och tillsätt 500 μL buffert AW1 utan att väta fälgen. Stäng locket och centrifugen vid 6000 x g i 1 min. Placera minispinnkolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera uppsamlingsröret som innehåller filtratet.
      9. Öppna försiktigt minispinnkolonnen och tillsätt 500 μL buffert AW2 utan att väta fälgen. Stäng locket och centrifugen med full hastighet (20 000 x g) i 3 minuter.
      10. Placera minispinnkolonnen i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör och kassera det gamla uppsamlingsröret med filtratet. Centrifugera med full hastighet i 1 min för att eliminera risken för eventuell buffert AW2-överföring.
      11. Placera minispinnkolonnen i ett rent 1,5 ml mikrocentrifugerör och kassera uppsamlingsröret som innehåller filtratet. Öppna försiktigt minispinnkolonnen och tillsätt 200 μL Buffer AE eller destillerat vatten. Inkubera vid rumstemperatur (15-25 °C) i 5 min och centrifugera sedan vid 6000 x g i 1 min.
    2. Transgene-fri status PCR (med KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Se till att alla reagenser tinas upp och blandas ordentligt.
      2. Förbered en PCR-huvudblandning som innehåller lämplig volym av alla reaktionskomponenter baserat på tabell 2 (ställ in reaktioner på is).
      3. Överför lämpliga volymer pcr-huvudmix, mall och primer till enskilda PCR-rör.
      4. Kåpa individuella reaktioner, blanda och centrifugera kort.
      5. Utför PCR enligt tabell 3.
  3. Identifiering av pluripotensbiomarkör
    1. Alkalisk fosfatas (AP) färgning
      1. Förbered en 1x AP levande fläckarbetslösning genom att späda ut 3 μL 500x lagerlösning i 1,5 ml DMEM/F-12 för varje 10 cm2 odlingsområde.
      2. Ta bort mediet från iPSC-odlingsfatet. Tvätta kulturen med DMEM/F-12 en gång. Tillsätt 1x AP levande fläcklösning på iPSCs. Inkubera vid 37 °C i 45 min.
      3. Ta bort AP-fläcken och tvätta två gånger med DMEM/F-12. Tillsätt färsk DMEM/F-12 och bild under fluorescerande mikroskop med ett standard FITC-filter inom 30-90 min färgning.
    2. Immunostaining för pluripotensbiomarkörer
      1. Fixera sammanflödeskulturer iPSC med 4% paraformaldehyd över natten vid 4 °C. Tvätta tre gånger med PBS Tween 20 (PBST), varje tvätt i 5 min.
      2. Permeabilisera cellerna med 0,3% Triton X-100 i PBST i 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta tre gånger med PBST.
        OBS: Permeabilisering bör endast göras för intracellulära antigener.
      3. Blockceller med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBST i 30 min vid rumstemperatur. Färga cellerna med primära antikroppar (utspädda 1:1000 i 1% BSA) över natten. Efter primär antikropp inkubation, tvätta tre gånger med PBST.
      4. Inkubera celler med den sekundära antikroppen (utspädd 1:1000 i 1% BSA) i 5 timmar vid rumstemperatur. Tvätta tre gånger med PBST.
      5. Märk kärnorna med 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 1 minut. Tvätta cellerna en gång med PBST.
      6. Ta bilder under fluorescerande mikroskop.

6. In vitro-differentieringsanalyser

  1. Embryoidkroppsdifferentiering (EB)
    1. Skär iPSC-kolonierna i små bitar, samla och plätera i petriskålar med låg fastsättning i embryoidkroppsmedium. Odla cellerna i 15 dagar genom att ersätta medium var tredje dag.
      OBS: Dagen 15 EBs kan användas direkt för detektion av de tre bakterieskiktsbiomarkörerna. Alternativt kan specifika celllinjer induceras med tillväxtfaktorer, följt av biomarkördetektering.
  2. Differentiering av Endoderm (Hepatocyte)
    1. Odla iPSCs i monolayer kulturer i pluripotency medium.
    2. När du har konfluent, skifta till RPMI 1640 media med 1x Insulin Transferrin Selenite och 100 ng/mL activin A i 2 dagar, följt av tillväxt i RPMI 1640 media med 30 ng/mL bFGF och 20 ng/mL BMP4 i 9 dagar. Byt ut medium varannan dag.
    3. Från dag 10 och framåt, komplettera media med 0,1 μM dexametason. Avsluta experimentet dag 20.
  3. Differentiering av mesoderm (cardiomyocyte)
    1. Plätera dag 8 EBs på 0,5% Matrigel-belagda plattor i embryoidkroppsmedium. Låt EBs fästa och komprimera.
    2. Komplettera media med 20 ng/mL BMP4 och växa i 20 dagar. Byt ut medium var 2-3 dagar. Avsluta experimentet dag 20.
  4. Differentiering av ectoderm (neuronal)
    1. Plätera dag 4 EBs på 2 μg/cm2 kollagen typ IV-belagda plattor i embryoid kroppsmedium. Låt EBs fästa och komprimera.
    2. Nästa dag, skifta medium till DMEM F-12 med 2mg/mL glukos, 1x Insulin Transferrin Selenite och 2,5μg/mL fibronectin. Avsluta experimentet dag 15.
  5. Bildande av cerebrala organoider
    1. Odla TSiPSCs i en 35 mm vävnadskulturrätt på MEFs till 70-80% confluent. Skär kolonierna och samla i ett 15 ml-rör. Centrifugera cellerna vid 225 x g i 5 min. Kasta supernatanten.
    2. Tvätta kolonierna genom att återanvända i 2 ml PBS och centrifugera för att avlägsna supernatanten.
    3. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin och tryck på röret för att lossa cellerna. Inkubera röret vid 37 °C i 3-4 minuter för att separera kolonibitarna till en enda cellfjädring.
    4. Neutralisera trypsin genom utspädning med 4 ml pluripotensmedium som innehåller 10 μg/ml rhoassocierad proteinkinashämmare (ROCK) hämmare Y-27632 dihydroklorid (ROCKi) för att förhindra dissociation inducerad celldöd.
    5. Centrifug för att få en pellet. Kassera supernatanten och återanvända cellerna i 2mL embryoid kroppsmedium som innehåller 10 μg/mL ROCKi.
    6. Ta bort 10 μL cellfjädring för cellräkning. Tillsätt 10 μL Trypan blå för att upptäcka döda celler. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
    7. Tillsätt lämplig volym embryoidkroppsmedium med ROCKi till cellupphängningen för att erhålla 9 000 levande celler per 150 μL.
    8. Platta 150 μL i varje brunn på en lågtillsatt 96-brunnsplatta och inkubera i en fuktad CO2-inkubator vid 37 °C. Kontrollera plattorna för aggregering efter 24 timmar. På dag 2 ta försiktigt bort mediet och ersätt med färskt embryoidmedium utan ROCKi.
    9. På dag 6, överföra EBs till brunnar av en låg fastsättning 24 brunnsplatta som innehåller 500 μL neural induktionsmedium bestående av DMEM-F12 med 1% N2 tillägg, 2 mM GlutaMAX tillägg och 1 mM icke-essentiella aminosyror och 1 μg/mL heparin. Byt medium varannan dag.
    10. Efter 5 dagar i neural induktionsmedium bädda in neuroepithelialaggregaten i Matrigel genom att lägga en 2 cm x 2 cm kvadrat parafilm över en tom spetsbricka med 200 μL-spetsar. Tryck på parafilm med handskar över varje hål i spetsbrickan för att göra små bucklar. Rengör parafilm med 70% etanol för sterilisering.
    11. Överför parafilmen kvadrat till en 60 mm skål. Använd skärspetsar på 200 μL för att överföra neuroepithelialaggregaten till buckorna i parafilm. Ta bort överflödigt medium genom pipettering.
    12. Tillsätt 30 μL tinad matrigel på neuroepithlialaggregaten och placera aggregatet i mitten av Matrigel med hjälp av en pipettspets. Placera 60 mm skålen i 20-30 min i en 37 °C inkubator för matrigelen att polymerisera.
    13. Tillsätt 5 ml cerebral organoid differentiering medium bestående av 1:1 DMEM-F12: Neurobasal medium, 0,5% N2 tillägg, 2,5 μg/ml insulin, 2 mM GlutaMAX tillägg, 0,5 mM NEAA, 1% B27 tillägg och 2,5 ml penicillin-streptomycin.
    14. Använd en steril tång och vänd parafilmsplåten och agitera skålen tills matrigelinbäddade aggregat faller av arket i mediet. Odla de inbäddade aggregaten i en fuktad CO2-inkubator vid 37 °C i 4 dagar och ge medieförändringar varannan dag.
    15. Efter 4 dagars statisk kultur placera 60 mm disken på en orbital shaker installerad inuti inkubatorn som skakar vid 50 rpm. Kultur organoiderna i 3 månader ger fullständiga media förändringar med cerebral organoid differentiering medium var tredje dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av integrationsfria iPSCs från ett spontant aborterat foster med 45XO karyotyp
Vi isolerade fibroblaster från FCV med en Turner syndrom (TS) specifika 45XO karyotyp och nukleofected dem med episomal omprogrammering plasmider för att generera TSiPSCs som kan användas för nedströms modellering av syndromet, särskilt de associerade neurologiska underskotten (figur 1a&b). Vi använde icke-integrerande episomala vektorer och nukleofection för transfekteringsexperimenten (figur 1 c&d). Vi följde morfologiska förändringar av celler för att övervaka framgången med omprogrammering. Övergången från fibroblast till epitelial morfologi, följt av en avgränsad kompakt kolonibildning observerades (figur 2a). TSiPSCs förvärvade mänskliga embryonala stamceller som morfologi med distinkta kanter och ett högt kärn-till-cytoplasma-förhållande runt dag 20 efter transfektion(figur 2b). Däremot förvärvar ofullständigt omprogrammerade celler epiteliella morfologier men misslyckas med att bilda kompakta kolonier. (Figur 2c).

Karakterisering av TSIPSCs
Karyotypning av TSiPSCs visade 45XO karyotyp som är associerad med Turner syndrom (figur 3a). Immunofluoreescence av TSiPSCs visade uttryck för pluripotency transkription faktorer OCT4, NANOG, SOX2 och cell ytan markörer SSEA4, E-Cadherin och TRA-1-81. Mänskliga embryonala stamceller är guldstandarden för pluripotenta stamceller. Vi utförde samtidigt immunofluorescens av HUES 1 som användes som positiv kontroll för jämförelse av pluripotency biomarkör uttryck av TSiPSC (figur 3b). Transgene fri status för TSiPSCs visades av en genomisk DNA PCR för episomal plasmid markörer OriP och EBNA. Genom passage 15 förlorades OriP och EBNA genen i TSiPSCs.Episomal generna OriP och EBNA förstärktes och visade band i passage 9 TSiPSCs som anger förekomsten av episomal plasmids i detta skede. Dessa gener förstärktes dock inte i passage 15 TSiPSCs som indikerar en förlust av episomala plasmider och därmed ett transgenefritt tillstånd (figur 3c).

In vitro-differentieringsanalyser
Differentieringspotentialen hos TSiPSC-linjer visades in vitro. TSiPSCs vid aggregering i lågtillsättningsplattor bildade embryoidkroppar(figur 4a). Tillväxtfaktor inducerad differentiering av TSiPSCs användes för att generera celltyper av de tre könscellerna lager. Immunofluorescensanalys med hjälp av härstamningsspecifika biomarkörer bekräftade att TSiPSCs differentierade i representativa derivat av endoderm (SOX17), mesoderm (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β) och ectoderm (βIII TUBULIN) (figur 4b).

Cerebral organoid differentiering.
TSiPSCs differentierades som cerebrala organoider på ett stadium klokt sätt. Encelliga suspensioner av TSiPSCs aggregerades i embryoidkroppar för att stimulera utvecklingen av könsceller under de första 6 dagarna följt av induktion av neuroepithelial utveckling i 5 dagar. Neuroepithelial aggregerade var dem inbäddade i Matrigel som tillhandahöll extracellulär matris och källare membran komponenter som stöder korrekt apicobasal orientering, utväxt av neuroepithelial knoppar som expanderar och bildar lumen. Immunofluorescens med neuroepithelial markör NESTIN utfördes för att observera organoidernas övergripande morfologi (figur 5b). Neuroepitheliumet omger en ventrikelliknande hålighet(figur 5c - vit linje). Organoiderna visar morfologiskt ventrikulära zoner (VZ), sub ventrikulär zon (SVZ) och cortex som regioner(figur 5c - röda, orange respektive gula linjer)

Figure 1
Figur 1: Fibroblast isolering och omprogrammering via nukleofection.  a) Mikroskopisk bild av fetala korioniska villi före kollagenasbehandling. b)Fibroblaster isolerade från fetala korioniska villi för omprogrammering av experiment. c)Kontroll av omprogrammering av plasmider genom EcoRI-begränsningsrötning. (d) Schematiskt diagram över transfekteringsprotokoll som används för iPSC-generering från fetala korionella villi fibroblaster med episomal omprogrammering av plasmider via nukleofection. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Etablering av Turners syndrom inducerade pluripotenta stamceller. a)Cellmorfologiska förändringar som observerats under omprogrammeringstiden. b)En helt omprogrammerad TSiPSC-koloni. c) En representativ bild av en koloni med felaktigt omprogrammerade celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av TSIPSCs.  a)Karyotyp av TSIPSCs. b)Immunofluorescensanalys av pluripotensbiomarkörer OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 och TRA-1-81 i TSiPSCs jämfört med embryonala stamcells hues1. Kärnor är färgade med 4', 6-diamidino-2-fenylindole. 3c. Demonstration av transgene fri status för TSiPSCs. Lane 1- DNA-stege, Lane 2- OriP positiv kontroll med pCXLE-hSK, Lane 3- EBNA positiv kontroll med pCXLE-hSK, Lane 4-OriP med TSiPSCs, Lane 5-EBNA med TSiPSCs. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: In vitro-differentieringspotential för TSIPSCs.  a)TSiPSC differentierad till Embryoidkroppar. b)Immunofluorescensanalyser av TSiPSCs för endodermal markör SOX17, mesodermal markör myosin ventrikulär tung kedja α/β och ectodermal markörer βIII tubulin och SOX2. Kärnor är färgade med 4', 6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Neuronal och cerebral organoid differentiering av TSiPSCs.  (a) För att förstå cytoarchitecture av differentierade nervceller gjordes phalloidin färgning av Actin. TSiPSC-härledda nervceller visade pyramidal formad neuronal soma (pilspets) med dendriter och axoner (pilar). Kärnor är färgade med 4', 6-diamidino-2-fenylindole. Immunostaining. a)Immunostaining för Nestin och aktin för att observera organoidernas bruttomorfologi. c)Färgning för Nestin för att visualisera de apiskt och basalt organiserade neuronala skikten. Kärnor är färgade med 4', 6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Tabell 1: Sammansättning av media, buffertar och lösningar Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: PCR Reaction Mix Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 3: PCR Cycling Program Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering av stabila cellulära modeller av cytogenetiskt onormal fetala vävnad är nödvändigt för att upprätthålla defekta fenotyp. IPSC-rutten är den mest effektiva metoden för cellberedning för evig bevarande av defekta egenskaper20.

Pluripotenta stamceller (PSC) visar egenskaper hos självförnyelse och differentiering i specialiserade celler som påminner om tidiga klyvningsembryon21. Därför kan PSCs fungera som utmärkta modeller för att studera tidiga molekylära, cellulära och utvecklingsmässiga defekter i för tidigt aborterade foster.

I den här artikeln har vi beskrivit mänskliga iPSC generation med nukleofection kombinerat med de förbättrade episomal vektorer. Resultaten visar att denna kombination omfattar en robust metod för att generera integrationsfria mänskliga iPSC-linjer, vilket framgår av det faktum att enstaka transfekteringar var tillräckliga för framgångsrik omprogrammering. Vi spårade den progressiva omvandlingen av FCV fibroblaster till pluripotent celler mikroskopiskt. 20 dagar efter transfection observerade vi kolonier av omprogrammerade TSiPSCs omgiven med icke-omprogrammerade FCV fibroblaster. Morfologiskt liknade de härledda mänskliga iPSCs embryonala stamceller som odlades tillsammans i labbet. Vanligtvis aggregeras cellerna som kompakta kolonier med glänsande kanter. Cellerna i kolonierna hade stora kärnor och tätt packade vilket tyder på nära membrankontakt mellan cellerna. De icke-omprogrammerade fibroblaster välvda och omgav dessa kolonier. Vid överföring till iMEF fortsätter de att sprida sig i kultur för över 30 överföringar som visar egenskapen av fortsatt självförnyelse.

Som TSiPSCs genererades från 45XO fibroblaster vi karyotypade cellerna för att kontrollera om de behöll kromosomal kompositionen. TSiPSCs bibehöll 45XO karyotyp i cellen kontinuerlig kultur föreslår en stabil 45XO kromosom genetisk makeup. För att vara användbar som cellulära resurser som representerar 45XO aneuploidy bör TSiPSCs vara fria från exogent DNA som används i omprogrammeringsexperimenten. Vi kontrollerade förekomsten av resterande episomal plasmider genom att utföra en genomisk DNA PCR för episomal specifika markörer-OriP och EBNA. Vi hittade inga spår av dessa markörer i TSiPS celler efter 15 passager tyder på att TSiPSCs gradvis förlorat episomal omprogrammering vektorer i långvarig kultur.

Kännetecknet för en pluripotent celler är dess potential att skilja sig från celler av tre groddar både in vitro och in vivo. För att testa denna förmåga i härledda TSiPSCs utsatte vi dem in vitro för embryoid kroppsbildning och differentiering analyser riktade genom härstamning som specificerar cytokiner och tillväxtfaktorer. TSiPSCs bildade embryoidkroppar och differentieras i ectodermal celler uttrycker neuronala markörer, mesodermal celler uttrycker hjärt markörer och endodermal celler uttrycker SOX17 en biomarkör för endoderm öde. Vi testade också förmågan hos TSiPSCs att differentiera sig i högre ordning 3D cerebrala organoider med hjälp av tidigare etablerade protokoll22. TSiPSCs gradvis självorganiserar på grund av sina egna inneboende utvecklingsprogram i minivävnader som kallas organoider. TSiPSCs gav cerebrala organoider visar en cytoarchitecture som liknar hjärnvävnad med neuroepithelium som omger en ventrikel som hålighet. Dessa organoider måste dock karakteriseras ytterligare i stor utsträckning för att avslöja de exakta celltyperna och jämfört med normala iPSCs för att skilja de inneboende neurala vävnadsmönsteregenskaperna hos TSiPSCs. Dessa cerebrala organoider och andra typer av hjärnan organoider genereras från TSiPSCs kan användas för att modellera utvecklingsmässiga och funktionella inkonsekvenser som kan bidra till symtomen på neurologiska brister hos TS individer. TSiPSCs uppvisade biomarkör egenskaper av pluripotency samt kännetecknet för differentiering således belyser framgången med omprogrammering till inducerad pluripotency.

Den ovan beskrivna metoden har fungerat effektivt vid omprogrammering av hudfibblaster och mesenkymala celler som härrör från olika källor i vårt labb (data från andra linjer som inte visas). Enligt vår erfarenhet är följande steg avgörande för att omprogrammeringsexperimentet ska lyckas:

a) Kvaliteten på plasmidberedningen: gamla preparat ger inte iPSC.
b) Kvaliteten på celler som används för transfektioner: prolifererande celler är viktiga för iPSC-generering. 0,5 till 1 miljon celler per transfektion gav en reproducerbar omprogrammering effektivitet.
c) Rekonstituerade rekonstituerade reagenser med nukleofektor: rekonstituerade nukleofutreagenser som lagrats i över en månad gav inte iPSC.
d) Underhåll av huvudcellsbanken genom mekanisk subkultur av iPSC:erna gav stabila linjer. Enzymatisk dissociation användes enligt experimentkrav.

Det framtida syftet med labbet är att upprätta en panel av kromosomalt onormala iPSCs för nedströms utveckling, funktionell och sjukdomsmodellering med denna effektiva metod. Fetala aneuploider orsakar graviditet förlust och organ missbildningar i levande födda. Aneuploid iPSCs härrör från vävnader av spontana abortuses är en värdefull resurs för att modellera och studera misslyckade embryonala utvecklingshändelser. In vitro 2D- och 3D-odlingssystem inklusive embryoida kroppar och vävnadsspecifika organoider22 kommer att göra det möjligt för forskare att förstå molekylära och cellulära oegentligheter såsom avvikande cellproliferation och celldöd i härstamning specifika celler som kan manifesteras som utvecklingsmässiga anomalier och graviditetsfel i samband med aneuploidy syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Ekonomiskt stöd till ovanstående forskning tillhandahölls av Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering av linjen genomfördes delvis i laboratoriet för M.M Panicker vid NCBS. Vi tackar Anand Diagnostic Laboratory för hjälp med karyotypning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 178 Omprogrammering Humanduced pluripotenta stamceller Aneuploidies Medfödda missbildningar Spontan fosterdöd Turnersyndrom Neurologiska underskott
Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Turners syndrom (45XO) Fosterceller för nedströms modellering av neurologiska underskott i samband med syndromet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter