Summary
Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar perfis de impressão digital de DNA amplificando o lócus VNTR D1S80 do DNA celular epitelial.
Abstract
Em ciências biológicas, a impressão digital de DNA tem sido amplamente utilizada para testes de paternidade, aplicações forenses e estudos filogenéticos. Aqui, descrevemos um método confiável e robusto para genotipagem de indivíduos por análise número variável de repetição tandem (VNTR) no contexto das aulas de laboratório de graduação. O lócus D1S80 VNTR humano é usado neste protocolo como um marcador altamente polimórfico baseado na variação do número de sequências repetitivas.
Este protocolo simples transmite informações úteis para os professores e a implementação de impressões digitais de DNA em aulas práticas de laboratório. No exercício laboratorial apresentado, a extração de DNA seguida de amplificação de PCR é usada para determinar a variação genética no lócus D1S80 VNTR. As diferenças no tamanho do fragmento dos produtos PCR são visualizadas pela eletroforese do gel agarose. Os tamanhos dos fragmentos e os números de repetição são calculados com base em uma regressão linear do tamanho e distância de migração de um padrão de tamanho de DNA.
Seguindo este guia, os alunos devem ser capazes de:
• Colher e extrair DNA das células epiteliais da mucosa bucal
• Realizar um experimento pcr e entender a função de vários componentes de reação
• Analisar os amplicons por eletroforese de gel agarose e interpretar os resultados
• Entenda o uso de VNTRs em impressões digitais de DNA e sua aplicação em ciências biológicas
Introduction
A impressão digital molecular, também referida como impressão digital de DNA, foi introduzida por Sir Alec Jeffreys enquanto trabalhava no Departamento de Genética da Universidade de Leicester em 19841. Baseia-se nos 0,1% do genoma humano que difere entre os indivíduos e é composto por aproximadamente três milhões de variantes. Essas diferenças únicas no genótipo permitem a diferenciação entre indivíduos e, portanto, podem funcionar como uma impressão digital genética, exceto para gêmeos monozígoticos. Consequentemente, a impressão digital de DNA é utilizada para a estimativa de parentescidade de diferentes indivíduos que é aplicada, por exemplo, em testes de paternidade ou em estudos de diversidade populacional. Em nossas aulas de laboratório, nosso objetivo era transmitir o conceito de impressão digital de DNA e frequências de alelo. O método descrito aqui demonstra um método confiável e robusto para impressão digital genética, analisando o Número Variável de Repetições tandem (VNTR) no lócus D1S80. O método compreende a extração de DNA de células epiteliais de mucosa bucal e subsequente Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) para amplificar o lócus D1S80, seguido pela visualização de diferenças de comprimento de fragmento em um gel de agarose.
O lócus minisatélite D1S80 VNTR é altamente variável e localizado na região telomérica do cromossomo 1 (1p36-p35). Foi identificado e descrito por Karsai e colegas de trabalho em 1990 como um lócus com uma unidade de repetição central de 16 bp, permitindo a separação de alelos diferindo por apenas uma unidade2. Além disso, o D1S80 apresenta um alto grau de variação com uma taxa de mutação de aproximadamente 7,77 x 10-53. D1S80 tem alto grau de heterozigosidade4,5 (por exemplo, 80,8% heterozigosidade para caucasianos6 e até 87% heterozigosidade para afro-americanos7). Além disso, o lócus D1S80 é polimórfico na maioria das populações, com tipicamente mais de 15 alelos diferentes carregando de 14 a 41 repetições cada. A frequência de alelos D1S80 varia entre as populações. O alelo com 24 unidades repetidas (alelo 24) é o mais frequente em populações europeias e asiáticas, enquanto o alelo 21 é mais comum nas populações africanas4,7,8,9,10. Consequentemente, as distribuições de frequência de alelo são diagnósticas para diferentes populações humanas e precisam ser levadas em conta para a estimativa de parentesco (por exemplo, em testes de paternidade).
A amplificação baseada em PCR do lócus D1S80 VNTR tem sido um método muito útil em ciência forense, testes de paternidade, análise de doenças e estudos de diversidade populacional11,12,13,14. Enquanto na perícia de hoje o uso de VNTRs foi substituído por repetições de tandem curto, o lócus D1S80 VNTR é amplamente utilizado na determinação de origens e relações genéticas entre e entre as populações4,8,9,11. Além disso, é frequentemente usado para ensinar impressão digital de DNA em aulas práticas de laboratório15,16. O método descrito aqui representa um método robusto, econômico e fácil de usar, com uma taxa de sucesso muito alta nas aulas de laboratório de graduação. O objetivo deste artigo é fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho para a análise molecular do locus minisatélite humano D1S80 das células epiteliais buccal mucosa. Inclui demonstração de técnicas, protocolos simplificados e sugestões práticas descritas em trabalhos publicados anteriormente2,17.
Protocol
NOTA: Este protocolo só deve ser utilizado se estudantes ou respectivos responsáveis legais concordarem com a condução deste protocolo como perfis genotipos dão insights sobre as relações genéticas. A impressão digital do DNA é um método comum de biologia molecular aplicado principalmente a estudos populacionais e questões forenses. Portanto, deve-se dedicar a atenção para manter os riscos de contaminação o mais baixos possível. Para evitar a contaminação da amostra com DNA de uma fonte externa ou DNases, as luvas devem ser usadas, os instrumentos devem ser completamente limpos ou esterilizados e as soluções devem ser esterilizadas ou autoclavadas antes do uso.
1. Colheita de células epiteliais mucosas buccal
ATENÇÃO: O trabalho com saliva e células epiteliais pode levar à transmissão de doenças infecciosas. Portanto, devem ser aplicadas precauções padrão e baseadas na transmissão (por exemplo, o uso de equipamentos de proteção individual adequados).
NOTA: Inclua um controle positivo, que é fornecido pelo instrutor (por exemplo, DNA extraído pelo instrutor) e incluído nas etapas de processamento a jusante.
- Aguarde pelo menos 1h depois de comer ou escovar os dentes antes da coleta do espécime.
- Rotule um tubo de microcentrifuge vazio e estéril de 2,0 mL.
- Remova um cotonete bucal estéril da embalagem e esfregue vigorosamente no interior da bochecha por 30-40 vezes ou 30-40 segundos para colher células epiteliais bucais de mucosa.
- Coloque a ponta do cotonete de coleta no tubo de microcentrifuse estéril previamente rotulado e quebre o comprimento do plástico que se estende além da borda, seja à mão ou usando uma tesoura estéril.
- Coloque a tampa com segurança no tubo, selando o cotonete de coleta dentro.
2. Extração de DNA genômico de células humanas
- Antes da extração, coloque uma batedeira térmica ou um bloco de aquecimento a 65 °C para a lise amostral.
ATENÇÃO: Alguns produtos químicos utilizados são classificados como perigosos. Leia atentamente a ficha de dados de segurança e tome as medidas de segurança apropriadas antes de manusear.- Prepare e esterilize filtrando ou autoclavando todos os buffers e soluções necessárias (solução de lise, acetato de potássio de 8 M, 2-propanol, 70% de etanol e tampão de eluição).
NOTA: Todas as etapas de centrifugação devem ser executadas à temperatura ambiente (20-30 °C) a menos que especificado.
- Prepare e esterilize filtrando ou autoclavando todos os buffers e soluções necessárias (solução de lise, acetato de potássio de 8 M, 2-propanol, 70% de etanol e tampão de eluição).
- Adicione 500 μL de solução de lise (50 mM Tris/HCl, pH 8.0; 10 mM de ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA); 2% sulfato de dodecil de sódio (SDS)) ao cotonete bucal, certificando-se de que a amostra esteja completamente imersa na solução de lise.
- Vórtice vigorosamente por pelo menos 5 s.
- Incubar amostras a 65 °C em uma batedeira térmica por 10 minutos.
- Misture a amostra 3-4 vezes por vórtice de pulso para 5 s durante a incubação.
- Remova o cotonete do tampão de lise, pressione o cotonete contra o interior do tubo para obter o volume máximo da amostra.
- Adicione 100 μL de acetato de potássio de 8 M a células lysed.
- Misture bem invertendo o tubo até que haja um precipitado branco.
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Centrifugar a amostra por 5 min a 18.000 x g.
- Transfira 450 μL do supernante para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL limpo e estéril.
- Adicione 450 μL de 2-propanol e misture bem invertendo o tubo (precipitação do DNA).
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Centrífuga por 5 min a 18.000 x g.
- Descarte o supernatante e inverta o tubo em uma toalha de papel limpa para secar a pelota e evitar contaminação cruzada.
- Incubar o DNA por 5 min a 65 °C em um bloco de aquecimento para secar completamente a pelota.
- Para lavar o DNA, adicione 500 μL de 70% de etanol.
- Centrífuga por 1 min a 18.000 x g.
- Descarte o supernatante e inverta o tubo em uma toalha de papel limpa para secar a pelota.
- Adicione 30 μL de tampão de resuspensão (10 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) à pelota.
- Incubar o DNA por 10 min a 65 °C em um bloco de aquecimento para inativar DNases.
3. Amplificando o lócus D1S80 VNTR usando PCR
NOTA: Registo o número de amostras que serão utilizadas e prepare uma planilha com os reagentes necessários e seus volumes antes de coletar os plásticos e outros materiais necessários. Rotule os tubos/tiras/placas estéreis a serem utilizados para o PCR com números de amostra. Lembre-se de incluir um controle negativo usando H2O em vez de DNA e um controle positivo (por exemplo, usando o DNA fornecido pelo instrutor) para validar o PCR.
- Prepare o mix mestre 1x PCR contendo 10 μL de 5x tampão de reação PCR (contendo 15 mM MgCl2), 1 μL de triphosfato de desoxiribonucleotídeo (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) de cada primer pMCT118-f e pMCT118-r (para frente - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACACTGCCCCCCCG-3', reverso - 5'-GTCTTGTTGTTGAGATACACCCCCCCTTGC-3') de acordo com Kasai et al.2, 23,8 μL de ultrapure H2O, e 0,2 μL de polimerase de DNA Taq (5 U/μL).
NOTA: Os primers pMCT118-f/pMCT118-r foram projetados nas regiões de flanqueamento da região de VNTR D1S80 amplificando todo o lócus. - Rotule os tubos/tiras/placas PCR com os números de amostra a serem utilizados.
- Alíquota de 45 μL da mistura mestre a cada tubo de amostra PCR rotulado ou bem.
- Adicione 5 μL do modelo de DNA à mistura mestre em cada tubo/placa PCR bem para adquirir um volume total de 50 μL. Altere a ponta da pipeta para cada amostra de DNA para evitar contaminação cruzada.
- Inclua um controle sem modelo (NTC) usando ultrapure H2O em vez de DNA.
- Feche tubos/tiras PCR ou placa de vedação e misture.
- Centrifugar os tubos/tiras/placas PCR por 20 s usando uma centrífuga de mesa.
NOTA: As condições de PCR dadas neste protocolo foram otimizadas utilizando-se o polimerase de DNA e o ciclo-condicionado térmico PCR utilizado. Em geral, as condições de PCR devem ser adaptadas à polimerase de DNA. O tempo de extensão padrão para uma polimerase de DNA Taq é de 1 min/kb. - Coloque os tubos de amostra/tiras/placa no termociclador e incubar reações usando as seguintes condições (tempo de extensão de polimerase de DNA): 1 ciclo de 95 °C por 2 min; 25 ciclos de 94 °C para 15 s, 60 °C para 15 s, 72 °C para 30 s; 1 ciclo de 72 °C por 10 min.
- Quando o programa estiver concluído, remova os produtos do termociclador e armazene a 4 °C durante a noite ou -20 °C até a eletroforese.
4. Eletroforese de gel agarose de produtos PCR
- Prepare um gel de 1,5% de agarose.
- Use 1,5 g de pó de agarose e misture-o com 100 mL de 1x Tris-acetato-EDTA (TAE) solução tampão em um frasco.
- Aqueça a mistura por cerca de 1,5-2 min em um forno micro-ondas (600 W). Gire o conteúdo e aqueça novamente, se necessário, para dissolver completamente a agarose. Esfrie ligeiramente e adicione 2 μL de PeqGreen à agarose.
- Despeje o gel em uma forma usando um pente com poços suficientes para todas as amostras e adicione pelo menos um marcador de peso molecular.
ATENÇÃO: Pode ocorrer retardo fervente. Agite o frasco cuidadosamente ao reutilizar a agarose que ainda não foi dissolvida.
NOTA: PeqGreen é um corante não tóxico para a detecção de ácidos nucleicos. É aplicável para coloração de DNA de dupla fita (dsDNA) e DNA mono-encalhado (ssDNA) bem como RNA. A sensibilidade é comparável ao brometo de ethidium.
- Retire os produtos PCR de 4 °C e centrífuga por cerca de 10 s.
- Carregue os poços do gel com amostra de 10 μL. Não sobrecarregue o gel.
NOTA: O tampão de polimerase de DNA também inclui compostos que aumentam a densidade amostral para que as amostras possam ser carregadas diretamente em géis sem a necessidade de um corante de carregamento. Isso permite que a amostra afunde no poço e os corantes ajudam a rastrear até onde a amostra de DNA migrou.- Adicione um padrão de peso molecular aos poços de flanqueamento (de preferência um padrão de peso molecular de 50 bp).
NOTA: Armazene as amostras residuais de PCR a -20 °C caso a eletroforese do gel agarose tenha que ser repetida.
- Adicione um padrão de peso molecular aos poços de flanqueamento (de preferência um padrão de peso molecular de 50 bp).
- Execute o gel em 1x TAE em 150 V (constante) por aproximadamente 40 minutos ou até que a frente de corante amarelo inferior que viaja em torno de 50 bp atinja a extremidade inferior do gel.
- Imagem do gel enquanto luz azul ou luz ultravioleta (UV) é aplicada e registra uma imagem para análise de comprimento de fragmento.
ATENÇÃO: A luz UV pode danificar seus olhos e pele. Use sempre roupas protetoras e óculos de segurança UV ao usar uma caixa de luz UV. - Descarte o gel de acordo com a política institucional de materiais perigosos.
5. Análise dos resultados do comprimento do fragmento
NOTA: Utilize a análise de regressão linear para estimar os comprimentos dos fragmentos.
- Para dimensionar os fragmentos de PCR D1S80, coloque uma régua sobre a fotografia de gel sobre a faixa padrão de peso molecular de 50 bp, de tal forma que o topo da régua se alinha com a parte inferior do poço em que a amostra foi carregada(Figura 1).
NOTA: Para calcular a equação de regressão linear para o padrão de peso molecular (padrão de peso molecular de 50 bp) foi utilizado um programa de planilha. - Registo a distância do poço (por exemplo, em cm) para cada faixa do padrão de peso molecular de 50 bp em uma tabela usando um programa de planilha(Figura 2).
- Determine o tronco (por exemplo, base 10) de cada tamanho de fragmento do padrão de peso molecular de 50 bp e digite os valores de tronco na tabela(Figura 2).
- Plotar cada ponto de dados para um gráfico com o registro dos tamanhos da banda no eixo vertical (eixo y) e a distância de execução medida da parte superior do gel para cada faixa do padrão de peso molecular no eixo horizontal (eixo x) usando um talo de dispersão(Figura 3).
- Encaixe uma linha de tendência (linha de regressão linear) e mostre a equação de regressão (y = ax + b) e o valor R2 no gráfico(Figura 4).
- Meça a distância migrada (por exemplo, em cm) para cada amplicon D1S80 (Figura 5).
- Estime o tamanho de cada amplicon D1S80 usando a equação de regressão: y = ax + b
onde y = o registro do tamanho do fragmento
a = a inclinação da linha (calculada no ponto 5)
x = a distância do poço (em cm)
b = o ponto onde a linha de regressão intercepta o eixo y (calculado no ponto 5)
NOTA: Uma vez que o valor y representa o registro do tamanho do fragmento, o antilog (10y) deve ser calculado para obter o tamanho do fragmento em bp dos amplicons D1S80.
6. Estimativa do número de unidades repetidas nos alelos dos indivíduos testados
NOTA: A unidade de repetição D1S80 tem 16 bp de comprimento. O menor alelo conhecido para D1S80 tem 14 repetições. O esquema de amplicon descrito aqui produz amplicons com regiões de flanqueamento somando 145 bp extras ao tamanho final.
- Use a Tabela 1 para estimar quantas unidades de repetição estão contidas em cada fragmento pcr. O tamanho extrapolado usando a regressão linear deve estar dentro de 8 bp de qualquer alelo em particular.
- Registo o genótipo de cada indivíduo testado como uma combinação de números de tamanho de repetição de alelo.
Representative Results
Utilizando o protocolo descrito, a análise do marcador D1S80 VNTR foi realizada no DNA genômico humano extraído das células epiteliais buccal da mucosa colhidas por amostragem de cotonetes(Figura 6). Após a amplificação usando PCR, uma representação típica de um gel de agarose contendo os amplicons D1S80 é mostrada na Figura 1. A faixa 1 mostra o padrão de peso molecular de 50 bps. Ao lado do padrão de peso molecular, são visualizados produtos pcr de oito amostras de alunos. A faixa 10 mostra o NTC em que a água foi usada em vez de DNA de modelo. A maioria das amostras analisadas exibe claramente duas bandas, representando indivíduos heterozigosos para o lócus D1S80. Lane 2 e Lane 9 mostram uma única banda representando indivíduos homozigos para o lócus D1S80. Lane 5 está mostrando uma banda ambígua que é muito mais ampla em comparação com as outras bandas. Isso pode ser resultado de dois alelos D1S80 diferindo em apenas uma unidade de repetição. Para análise posterior, a amostra na faixa 5 será considerada como uma única banda, representando um indivíduo homozigoso.
A análise do fragmento de eletroforese de gel a jusante realizada em produtos PCR verificados foi utilizada para a chamada de tamanho do lócus D1S80 VNTR de diferentes amostras de estudantes. A interpretação dos tamanhos de amplicon obtidos pela análise pcr baseia-se no padrão de peso molecular utilizado. A distância do poço para cada faixa do padrão de peso molecular foi medida(Figura 1) e registrada(Figura 2). Com base no tamanho e na distância de migração, o tamanho das bandas individuais pode ser calculado utilizando uma análise de regressão linear. O registro (base 10) foi determinado para cada banda nas amostras estudantis(Figura 5) e o respectivo antilog representa o número de bp para cada amplicon. O número de unidades repetitivas pode ser calculado de acordo com o tamanho da amplicon obtido(Tabela 2).
Para cada amostra de aluno, os tamanhos de amplicon foram calculados por regressão linear e cada banda poderia ser facilmente atribuída a um alelo particular, como mostrado na Tabela 2. As informações sobre os tamanhos de alelo D1S80 podem então ser usadas para determinar as frequências de alelo entre o subconjunto populacional de estudantes de graduação. O alelo de 28 repetições é o mais frequente entre os alunos devido a dois indivíduos homozigosos para este alelo repetido (indivíduos 1 e 4). O segundo alelo mais frequente é o alelo de 18 repetições, que é carregado pelo indivíduo homozigoso 8 e pelo indivíduo heterozigoso 6. Os alelos de baixa frequência são os alelos de 21, 26 e 30 repetições encontrados apenas uma vez em indivíduos 6, 5 e 3, respectivamente. Os padrões de frequência de alelo do lócus D1S80 VNTR da pequena população estudantil podem ser ainda comparados com a frequência de alelo de populações humanas maiores, por exemplo populações originárias de diferentes continentes4,7,8,9,10.
Entre os estudantes, os indivíduos 2 e 3 compartilham o alelo 24-repetitivo, indivíduos 2 e 7 compartilham o alelo de 20 repetições e indivíduos 5 e 7 compartilham o alelo de 23 repetições. Curiosamente, os dois indivíduos homozigos D1S80 (indivíduo 1 e 4) compartilham o alelo de 28 repetições. A combinação de alelos entre dois indivíduos pode indicar uma potencial relação. No entanto, alelos compartilhados também podem ocorrer por acaso. Assim, é crucial determinar a probabilidade de um alelo coincidir entre dois indivíduos. A probabilidade depende da frequência de alelos individuais na população geral e abordagens estatísticas devem ser empregadas para anexar um peso estatístico à análise de marcadores VNTR, como a abordagem bayesiana. Em resumo, o método de impressão digital apresentado pode ser utilizado em práticas práticas de classe práticas práticas de classe para ensinar o uso de VNTRs na impressão digital de DNA e sua aplicação em ciência biológica.
Figura 1: Representação de um gel de agarose após eletroforese de produtos de amplificação D1S80 com uma régua colocada ao lado da faixa padrão de peso molecular de 50 bp. A faixa 1 contém o padrão de peso molecular de 50 bp, enquanto as faixas 2-9 contêm produtos de reação PCR. A faixa 10 contém o controle de modelo (NTC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Determinação da distância de migração do fragmento de DNA e registro de cada tamanho de fragmento do padrão de peso molecular de 50 bp. A distância do poço (em cm) para cada faixa do padrão de peso molecular de 50 bp é registrada e o tronco (base 10) para cada fragmento é determinado. Os valores são inseridos em uma tabela usando um programa de planilha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráfico de dispersão gerado pela traçação da distância de migração do fragmento de DNA do padrão de peso molecular no eixo x contra o tronco (base 10) do tamanho de cada fragmento no eixo y. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exploração da linha de regressão linear e equação de regressão, bem como o valor R2 para os dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Determinação do tamanho dos amplicons D1S80. A distância do poço para cada fragmento é inserida na equação de regressão. O antilog do valor y representa o tamanho do fragmento em bp. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Cronograma sugerido e fluxo de trabalho para análise VNTR D1S80. Todo o procedimento de análise de VNTR D1S80 apresentado aqui, desde a colheita de células epiteliais buccal até a avaliação do comprimento do fragmento, pode ser concluído dentro de um único dia útil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tamanho de alelo (em bp) | Número de repetições |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabela 1: Tamanho de amplicon para cada lócus D1S80 VNTR.
| individual | alelo | Distância (em cm) | Tamanho (em bp) | Número de unidades de repetição |
| 1 | homozigoso | 5 | 600 | 28 |
| 2 | Heterozigotos | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | Heterozigotos | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozigoso | 5 | 600 | 28 |
| 5 | Heterozigotos | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | Heterozigotos | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | Heterozigotos | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozigoso | 5.6 | 435 | 18 |
Tabela 2: Composição de alelo dos diferentes indivíduos testados. O número de unidades repetitivas pode ser aproximado de acordo com o tamanho de amplicon obtido pela análise de regressão linear.
Discussion
Aqui descrevemos um método simples e econômico para implementar impressões digitais moleculares em aulas práticas de graduação.
Para testar a variação genética no lócus D1S80, é necessária a coleta de amostras biológicas humanas juntamente com a extração e análise de DNA. É essencial que o uso ético dos espécimes biológicos humanos seja assegurado durante todo o processo. O gerenciamento de amostras é controlado dentro de um quadro regulatório abrangente que garante o uso correto de amostras e dados associados18 (por exemplo, consentimento para o uso de material biológico humano). Os participantes devem ser devidamente informados sobre o uso de suas amostras, o risco de descoberta de anomalias nas relações genéticas (por exemplo, para indivíduos relacionados), proteção de privacidade e intenções para armazenamento futuro dos espécimes biológicos e dados. Todos os doadores (estudantes ou colegas) devem dar consentimento livremente e entender o direito de retirada sem dar motivo. Em geral, é indispensável se familiarizar com as respectivas diretrizes e regulamentos para a gestão de amostras humanas antes de realizar esta aula de laboratório.
Para a coleta de células epiteliais de mucosa bucal em cursos de laboratório de graduação, deve-se tomar cuidado para evitar a contaminação das amostras de DNA com DNA do operador ou com DNases. Recomenda-se que jalecos, luvas e óculos de proteção sejam sempre usados, bem como cotonetes estéreis e tubos de microcentrifusagem. A colheita de células à base de cotonete bucal é considerada um método conveniente e econômico para a coleta de material genético adequado para análise vntr baseada em PCR, pois é relativamente barata e não invasiva. Ao lado de cotonetes bucais, a saliva é o método de amostragem oral mais comum para pesquisa médica. Foi demonstrado que os cotonetes buccal contêm uma proporção maior de células epiteliais do que a saliva, tornando-as mais confiáveis no fornecimento de quantidade e qualidade suficientes de DNA para a análise D1S80 VNTR baseada em PCR19,20. Além disso, os cotonetes buccal podem ser enviados após a auto-coleta superando impedimentos geográficos quando utilizados, por exemplo, em estudos de diversidade populacional21.
A extração de DNA tornou-se relativamente fácil devido ao desenvolvimento de kits de extração de diferentes empresas. No entanto, o uso desses kits pode não ser adequado em aulas de laboratório devido a recursos financeiros limitados. Aqui, apresentamos um método fácil, rápido e econômico para extração de DNA a partir de amostras humanas sem a necessidade de um kit de extração de DNA comercialmente disponível. O método de extração de DNA descrito não usa solventes orgânicos, em vez disso, proteínas celulares são removidas aumentando a concentração de sal usando uma solução de acetato de potássio de 8 M. Este método também permite o manuseio de várias amostras ao mesmo tempo e produz em DNA suficiente para várias análises genótipos para cada amostra.
PcR é uma técnica comum em muitos laboratórios moleculares. Embora geralmente sem problemas, há armadilhas que podem complicar a reação produzindo resultados espúrios, que foram discutidos em outros lugares22. As condições de PCR apresentadas aqui têm aparecido muito robustas diante da má qualidade do DNA do modelo, mas a falta de amplificação do PCR foi observada ocasionalmente ao usar modelos com concentrações de DNA extremamente baixas devido à má colheita de células epiteliais buccal. Os primers de DNA utilizados neste estudo podem ser encomendados de diferentes empresas, como os citados na tabela de materiais no final deste artigo. Deve-se tomar cuidado especial ao trabalhar com primers de DNA, a fim de evitar contaminação com DNases ou DNA do operador. Os produtos PCR também devem ser mantidos frios quando não estão em uso.
Outro passo crítico é a eletroforese do gel agarose. Fragmentos diferentes por apenas uma unidade repetitiva de 16 bp não podem ser separados na eletroforese de gel e, portanto, aparecem como uma única banda. Neste caso, não é possível assegurar uma determinação adequada do número de unidades repetidas dos alelos D1S80 testados. Portanto, o tempo de execução do gel deve ser aumentado enquanto a tensão deve ser reduzida e a concentração de gel pode ser aumentada para proporcionar uma melhor resolução e separação das bandas únicas.
Vale ressaltar que nem todos os alelos para um lócus VNTR contêm unidades de repetição completas. Alelos não-consensivos (microvariantes) que contêm unidades de repetição incompletas são comuns na maioria dos locis VNTR e seus tamanhos caem entre tamanhos de alelos com unidades de repetição completas. Estes microvariantes mal são detectáveis pela eletroforese do gel agarose. Em contraste, técnicas como géis de poliacrilamida ou eletroforese capilar podem resolver alelos que diferem por uma a poucas unidades repetidas ou microvariantes12,23,24,25,26. No entanto, essas últimas técnicas são menos adequadas para aulas de laboratório de graduação, pois possuem muitas desvantagens, incluindo uso de compostos perigosos, preparação complexa e falta de equipamentos. Para a determinação do tamanho do fragmento, deve-se tomar cuidado especial ao medir a distância dos fragmentos de DNA migrados. Se as bandas forem muito difusas para serem medidas com precisão, o cálculo do tamanho do fragmento de alelo D1S80 por regressão linear pode estar incorreto, resultando na estimativa errada dos números da unidade repetida. Nesse caso, uma re-execução da eletroforese do gel agarose após a otimização das condições do gel é aconselhável como descrito anteriormente por Lorenz e colegas de trabalho22.
Todo o procedimento de análise de VNTR D1S80 apresentado aqui, desde a colheita de células epiteliais buccal até a avaliação do comprimento do fragmento, pode ser concluído em um único dia útil. Este protocolo é um método robusto, econômico e fácil de usar adequado para aulas de laboratório práticos de graduação.
Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Kevin Graham por sua dublador e a todos os participantes que doaram amostras para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
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