זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל
Summary
תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג’ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.
Abstract
תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג’ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.
Introduction
גליובלסטומה (GBM) הוא הסוג הנפוץ והאגרסיבי ביותר של גידול ראשוני במוח. נכון לעכשיו, ההישרדות הכוללת של חולי GBM שקיבלו טיפול מקסימלי (שילוב של ניתוח, כימותרפיה והקרנות) עדיין קצרה מ -15 חודשים; אז טיפולים חדשניים ויעילים עבור GBM נדרשים בדחיפות.
נוכחותם של תאי גזע גליומה (GSCs) ב- GBM מהווה אתגר ניכר לטיפול הקונבנציונלי שכן תאים דמויי גזע אלה ממלאים תפקידי מפתח בשמירה על מיקרו-סביבה של גידול, עמידות לתרופות והישנות גידול1. לכן, מיקוד GSCs יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול GBM2. עם זאת, חיסרון משמעותי ליעילות התרופה ב- GBM הוא אופיה ההטרוגנטי, כולל אך לא רק ההבדל במוטציות גנטיות, תת-סוגים מעורבים, ויסות אפיגנטי ומיקרו-סביבה של גידולים מה שהופך אותם עקשניים מאוד לטיפול. לאחר ניסויים קליניים כושלים רבים, מדענים וחוקרים קליניים הבינו כי טיפול ממוקד סוכן יחיד הוא כנראה מסוגל שליטה מלאה על ההתקדמות של סרטן הטרוגניים מאוד כגון GBM. בעוד, שילובי תרופות שנבחרו בקפידה אושרו ליעילותם על ידי שיפור סינרגטי את ההשפעה אחד של השני, ובכך לספק פתרון מבטיח לטיפול GBM.
למרות שיש דרכים רבות להעריך את האינטראקציות בין תרופתיות של שילוב סמים, כגון CI (אינדקס קומבינציה), HSA (הסוכן הבודד הגבוה ביותר) וערכי בליס וכו‘3,4, שיטות חישוב אלה מבוססות בדרך כלל על שילובי ריכוז מרובים. אכן, שיטות אלה יכולות לספק הערכה חיובית של אינטראקציה בין סמים לתרופות, אך יכולות להיות מייגעות מאוד אם הן מיושמות בהקרנת תפוקה גבוהה. כדי לפשט את התהליך, זרימת עבודה סינון לזיהוי מהיר של שילובי תרופות פוטנציאליים המעכבים את הצמיחה של GSCs שמקורם ביופסיות כירורגיות של GBM החולה פותח. מדד רגישות (SI) המשקף את ההבדל של האפקט המשולב הצפוי ואת האפקט המשולב שנצפו הוכנס לשיטה זו כדי לכמת את ההשפעה הסינרגית של כל תרופה, כך המועמדים הפוטנציאליים ניתן לזהות בקלות על ידי דירוג SI. בינתיים, פרוטוקול זה מדגים מסך לדוגמה כדי לזהות את המועמדים הפוטנציאליים שיכולים לסנן את אפקט האנטי-גליומה עם טמוזולומייד, הכימותרפיה בשורה הראשונה לטיפול GBM, בין 20 מעכבים מולקולריים קטנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי תואר פרוטוקול שניתן ליישם כדי לזהות טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות GSCs שמקורם במטופל. שלא כמו המודל המדדי הסטנדרטי של סינרגיה/תוספות כגון Loewe, BLISS או HSA, נעשה שימוש בזרימת עבודה פשוטה ומהירה שאינה דורשת שילוב של זוג תרופות בריכוזים מרובים באופן פקטורלי מלא כשיטות המסורתי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81672962), לקרן תוכנית החדשנות המחוזית של ג’יאנגסו ולקרן פרויקט המפתח המשותף של אוניברסיטת דרום מזרח והאוניברסיטה הרפואית נאנג’ינג על תמיכתם.
Materials
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. | |||
References
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
- Shi, Y., et al. Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance. Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).
- Tan, X., et al. Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV. Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).
- Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Recherche en cancérologie. 77 (9), 2488-2499 (2017).
- Malyutina, A., et al. Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer. PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).
- He, L., et al. Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring. Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).
- Chen, C., et al. Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).
