Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

Summary

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Abstract

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo descreve um fluxo de trabalho simples para permitir uma triagem rápida para terapia de combinação potencial com interação sinérgica. As etapas gerais deste fluxo de trabalho consistem em estabelecer GSCs com marca de luciferase, preparar placas revestidas de matrigel, triagem combinada de medicamentos, analisar e validar os resultados.

Introduction

Glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral primário. Atualmente, a sobrevida geral de pacientes com GBM que receberam tratamento máximo (uma combinação de cirurgia, quimioterapia e radioterapia) ainda é menor que 15 meses; por isso terapias novas e eficazes para GBM são urgentemente necessárias.

A presença de células-tronco de glioma (GSCs) no GBM constitui um desafio considerável para o tratamento convencional, uma vez que essas células-tronco desempenham papéis pivôs na manutenção do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e recorrência do tumor¹. Portanto, direcionar GSCs pode ser uma estratégia promissora para o tratamento GBM². No entanto, uma grande desvantagem para a eficácia da droga no GBM é sua natureza heterogenética, incluindo, mas não se limitando à diferença de mutações genéticas, subtipos mistos, regulação epigenética e microambiente tumoral, o que os torna muito refratários para o tratamento. Depois de muitos testes clínicos fracassados, cientistas e pesquisadores clínicos perceberam que a terapia-alvo de um único agente é provavelmente incapaz de controlar totalmente a progressão de cânceres altamente heterogêneos, como o GBM. Considerando que, combinações de medicamentos cuidadosamente selecionadas foram aprovadas para sua eficácia, aumentando sinérgicamente o efeito uns dos outros, fornecendo assim uma solução promissora para o tratamento de GBM.

Embora existam muitas maneiras de avaliar as interações medicamentosa-droga de uma combinação de drogas, como o CI (Índice de Combinação), HSA (Highest Single Agent) e os valores bliss, etc.^3,4, esses métodos de cálculo são geralmente baseados em múltiplas combinações de concentração. De fato, esses métodos podem fornecer avaliação afirmativa da interação medicamentosa-droga, mas podem ser muito trabalhosos se forem aplicados na triagem de alto rendimento. Para simplificar o processo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho de triagem para identificar rapidamente as combinações potenciais de medicamentos que inibem o crescimento de GSCs originados de biópsias cirúrgicas do GBM do paciente. Um Índice de Sensibilidade (SI) que reflete a diferença do efeito combinado esperado e o efeito combinado observado foi introduzido neste método para quantificar o efeito sinérgico de cada droga, de modo que os candidatos potenciais podem ser facilmente identificados pelo ranking SI. Enquanto isso, este protocolo demonstra uma tela de exemplo para identificar os potenciais candidatos que podem sinergizar o efeito anti-glioma com temozolomide, a quimioterapia de primeira linha para o tratamento de GBM, entre 20 pequenos inibidores moleculares.

Protocol

A amostra GBM foi adquirida de um paciente durante uma operação de rotina após obter o consentimento totalmente informado pelo comitê de ética em pesquisa humana do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing. 1. Isolamento e cultura de GSCs derivados do paciente Coloque tecido glioblastoma ressecado cirurgicamente fresco em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PBS estéril e armazene o tecido no gelo até uma nova operação. Pique o tecido GBM e…

Representative Results

As células XG387 formaram neuroesferas no meio de cultura descrito na Tabela 1 em uma placa de cultura de 6 poços de apego ultra-baixa ou uma placa não revestida5 (Figura 1A). Primeiro, foi realizado um teste para verificar se a intensidade de biolumescência das células XG387-Luc era proporcional ao número celular. Como mostrado na Figura 1B,a intensidade da biolumescência aumentou proporcionalmente à densidade ce…

Discussion

No presente estudo, foi descrito um protocolo que pode ser aplicado para identificar uma potencial terapia de combinação para GBM usando GSCs derivados do paciente. Ao contrário do modelo métrico de sinergia/aditividade padrão, como os métodos Loewe, BLISS ou HSA, foi utilizado um fluxo de trabalho simples e rápido que não requer que um par de drogas seja combinado em múltiplas concentrações de forma fatorial completa como os métodos tradicionais. Neste fluxo de trabalho, o SI (índice de sensibilidade) que ?…

Materials

B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.