Summary
Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) is de meest voorkomende Gram-negatieve bacterie die neonatale meningitis veroorzaakt. Het optreden van bacteriëmie en bacteriële penetratie door de bloed - hersenbarrière zijn onmisbare stappen voor de ontwikkeling van E. coli meningitis. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vertegenwoordigen de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen om de binnengevallen pathogenen te vernietigen. In dit protocol werd de tijdsafhankelijke intracellulaire ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met behulp van fluorescerende ROS-sondes die werden gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in zoogdiercellen tijdens interacties tussen pathogene gastheer en gastheer.
Introduction
Neonatale bacteriële meningitis is een veel voorkomende pediatrische infectieziekte. Escherichia coli (E. coli) met een K1 capsule is de meest voorkomende Gram-negatieve ziekteverwekker die neonatale bacteriële meningitis veroorzaakt, goed voor ongeveer 80% van de totale incidentie1,2,3. Ondanks de vooruitgang in de antimicrobiële chemotherapie en ondersteunende zorg, is bacteriële meningitis nog steeds een van de meest verwoestende aandoeningen met hoge morbiditeit enmortaliteit 4.
Het optreden van neonatale bacteriële meningitis begint meestal met bacteriëmie veroorzaakt door het binnendringen van pathogene bacteriën in de perifere circulatie van de lokale laesies van de pasgeborenen, gevolgd door penetratie door de bloed - hersenbarrière (BBB) in de hersenen, wat resulteert in de ontsteking van de hersenvliezen4. Het begin van bacteriëmie hangt af van de interactie tussen bacteriën en gastheerimmuuncellen, waaronder neutrofielen en macrofagen, enz. Neutrofielen, die goed zijn voor ~ 50-70% van de witte bloedcellen, zijn de eerste verdedigingslinie tegen bacteriële infecties5,6. Tijdens de invasie van bacteriën worden de geactiveerde neutrofielen gerekruteerd naar de besmettelijke locaties en geven reactieve zuurstofsoorten (ROS) vrij, waaronder het superoxide anion, waterstofperoxide, hydroxylradicalen en singlet zuurstof7. Ros ondergaat redoxreacties met het celmembraan, nucleïnezuurmoleculen en proteïnen van de bacteriën, resulterend in het letsel en de dood van de binnenvallende bacteriën8. De mitochondriën is de belangrijkste plaats van ROS-productie in eukaryotische cellen, en verschillende oxidasen (bijv. nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidasecomplex, lipoxygenasesysteem, eiwitkinase C en cyclooxygenasesysteem) bemiddelen de productie van ROS9,10. De real-time meting van de productie van ROS, die het primaire antimicrobiële mechanisme bij neutrofielen vertegenwoordigt, is een nuttige methode voor het bestuderen van gastheerverdediging tijdens de interactie tussen bacteriën en gastheer.
In dit protocol werd de tijdsafhankelijke ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met een fluorescerende ROS-sonde DHE, gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in andere zoogdiercellen tijdens de interactie tussen ziekteverwekker en gastheer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifeer bloed van vrijwilligers dat in dit onderzoek werd toegepast, werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de eerste Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Bereiding van reagentia en kweekmedium
- Bereid de rode bloedcellysebuffer voor door 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3,37,2 mg Na2EDTA toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water en de pH aan te passen tot 7,2-7,4. Verwijder de bacteriën door filtratie met 0,22 μm filters.
- Bereid het experimentele kweekmedium voor neutrofielen voor door 5% foetale runderserum toe te voegen aan RPMI 1640 medium en op te slaan bij 4 °C. Voor gebruik op kamertemperatuur brengen.
OPMERKING: Gebruik het RPMI 1640 medium zonder fenolrood. - Bereid fosfaatbufferoplossing (PBS) door 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO4 ·2H2O en 0,2 g KH2PO4toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water in een glazen kolf van 1 L. Stel de pH in op 7,2-7,4. Autoclaaf het gedurende 15 minuten bij 121 °C.
- Bereid rifampicineoplossing door 0,5 g rifampicinepoeder op te lossen in 10 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om een rifampicineoplossing van 50 mg/ml op te leveren.
- Bereid LB agar-oplossing door 10 g NaCl, 10 g trypton, 5 g gistextract en 15 g agarpoeder toe te voegen aan 1 L dubbel gedestilleerd water en het mengsel te autoclaafen. Vul de Petrischalen tot de helft van het volume door warme LB-agaroplossing met 100 μg/ml rifampicine te gieten. Bewaar de afgekoelde massieve plaat op 4 °C.
- Bereid hersenhartinfusie (BHI) bouillon geschikt voor bacteriële stammen door 37 g BHI-poeder op te lossen in 1 L dubbel gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,2 en autoclaaf deze.
- Los de fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) op in DMSO-oplosmiddel om een voorraadoplossing van 10 mM op te leveren. Voorzichtig mengen voor gebruik.
OPMERKING: Breng de voorraadoplossing onmiddellijk in lichtdichte flacons. De houdbaarheid van de voorraadoplossing is 6 maanden bij -20 °C.
2. Bereiding van E44-bacteriestam
OPMERKING: E44 is een mutante stam van meningitische E. coli met rifampicineresistentie.
- Dompel de cryopreserved E44 kolonie onder met een steriele pipetpunt, enen de E44 stam op de LB agar plaat die 100 μg/ml rifampicine bevat door lijnen te tekenen. Zet de plaat 's nachts ondersteboven in de incubator bij 37 °C.
- Pluk een dag voor het experiment een E44-kolonie van de plaat met een steriele pipetpunt en doe deze in 5 ml BHI-bouillon met 100 μg/ml rifampicine in een kolf van 50 ml. Incubeer de bacteriecultuur bij 37 °C met 90 tpm gedurende 17 uur in een incubatie shaker.
3. Isolatie van neutrofielen uit menselijk perifeer bloed
- Neem 5 ml bloedmonster van vrijwilligers intraveneus naar de vacuümbloedafnamebuis met EDTA voor anticoagulatie.
- Centrifugeer de perifere bloedmonsters gedurende 5 minuten op 500 x g. De bloedmonsters zijn verdeeld in drie lagen door centrifugeren, die van onder naar boven de rode bloedcel (RBC) laag, de witte bloedcel (WBC) laag en de plasmalaag, opeenvolgend zijn.
- Aspireer de witte bloedcellaag met een pipet naar een nieuwe buis met 3x RBC-lysisbuffer. Meng het mengsel grondig en plaats het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 500 x g. Aspireer het supernatant volledig en gooi het weg.
- Herhaal de lysisprocedure met RBC-lysisbuffer 1-2 keer, totdat het neerslag wit wordt.
- Was de cellen door het neerslag te resuspenderen met 2 ml PBS. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen tot op de bodem van de buis te laten bezinken.
- Label de neutrofielen met CD16 microbeads door het sediment opnieuw te bezinken met 50 μL voorgekoelde magnetische celsorteerbuffer. Meng vervolgens grondig met 50 μL menselijke CD16 microbeads. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op 4 °C.
OPMERKING: Oplossingen moeten voorgekoeld worden om aftopping van antilichamen op het celoppervlak en niet-specifieke etikettering te voorkomen. De meeste volwassenen hebben ongeveer 4.000 tot 10.000 witte bloedcellen per microliter bloed, waaronder neutrofielen goed zijn voor ongeveer 50-70%. Volgens schatting zijn de tellingen van de totale witte bloedcellen in 5 ml menselijk perifeer bloed meestal tot 2-5 x 107. - Was de cellen door 2 ml magnetische celsorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 4 °C, 300 x g. Gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer het neerslag met 500 μL sorteerbuffer.
- Monteer de magnetische kolom en de scheidingsplank. Verplaats de afscheider met de magnetische kolom naar de plank en spoel de kolom af met 3 ml sorteerbuffer.
- Laat de celsuspensie in de kolom vallen zodat de neutrofielen die door de magnetische kralen zijn gelabeld, zich aan de magnetische kolom kunnen hechten.
- Was de niet-gelabelde cellen af door 3 keer 3 ml magnetische celsorteerbuffer toe te voegen en zorg ervoor dat het kolomreservoir elke keer leeg is.
- Verwijder de kolom van de magneetscheider en plaats deze op een buis van 15 ml. Voeg 5 ml magnetische celsorteerbuffer toe aan de kolom. Duw de cellen met een magnetisch label naar buiten met behulp van een zuiger.
OPMERKING: Om de zuiverheid van de neutrofielen te verbeteren, kunnen de sorteerstappen worden herhaald met behulp van een nieuwe kolom. - Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 300 x g, gooi het supernatant volledig weg en resuspendeer het neerslag met 1 ml kweekmedium. Bepaal het celnummer met een celteller en bereid de cellen voor op verdere experimenten.
4. Meting van ROS
- Centrifugeer de geïsoleerde neutrofielen gedurende 5 minuten op 300 x g, resuspeneer het neerslag en pas de celconcentratie aan op 2 x 106/ml met een kweekmedium dat 5 μM DHE fluorescentiesonde bevat.
- Incubeer de neutrofielen gedurende 30 minuten bij 37 °C om de DHE-sonde te laden en wijs de celsuspensie vervolgens toe aan een 96-put zwarte polystyreenmicroplaat met 200 μL per put.
- Schakel de microplaatlezer in en open de detectiesoftware. Kies ondoorzichtig 96-wells plaatformaat en bepaal het leesgebied.
- Stel de fluorescentie (Ex/Em = 518/605 nm) elke 5 min in kinetische modus in gedurende 60 min op 37 °C. Zorg ervoor dat u de plaat voor elke meting 3 s schudt.
- Haal de microplaat uit de incubator, voeg de gekweekte E44 (MOI=100) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (100 ng/ml) toe aan elke put met voorgeladen neutrofielen met 3 replica's. Gebruik PMA als een positieve controle.
- Plaats de plaat in de microplaatlezer en start de test onmiddellijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, werden de neutrofielen geïsoleerd uit menselijk perifeer bloed en geladen met fluorescentiesonde DHE om de veranderingen van ros-niveaus als reactie op E44-infectie te detecteren. Hier leveren we representatieve gegevens die de ROS-productie aantonen die wordt opgeroepen door E44-stam, bepaald door een microplaatlezer in realtime. Door E44-stammen toe te voegen bij een MOI van 100 namen de ROS-niveaus onmiddellijk toe en vertoonden zij een continue opwaartse trend met een tijdsafhankelijke manier (figuur 1). Door PMA toe te voegen, een bekende ROS-inductor van intracellulair ROS bij neutrofielen, hebben we een S-vormige curve waargenomen die in het beginstadium een vlakke curve presenteert, gevolgd door een significante toename van 20 min naar 40 min en uiteindelijk een piek van 60 min (Figuur 1).
Figuur 1. Tijdsafhankelijke ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli. Neutrofielen geïsoleerd uit menselijk perifeer bloed werden geladen met DHE-kleurstof, een E44-stam (MOI = 100) werd toegevoegd en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) werd onmiddellijk bepaald met een microplaatlezer. Neutrofielen behandeld met PMA (100 ng/ml) werden gebruikt als een positieve controle. Alle gegevens werden genormaliseerd tot de beginwaarde om de relatieve DHE-intensiteit te verkrijgen en gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrofielen fungeren als de meest voorkomende component van witte bloedcellen in de menselijke bloedsomloop. Het zijn belangrijke effectorcellen in het aangeboren menselijke immuunsysteem, dat de eerste verdedigingslinie bouwt tegen de invasie van ziekteverwekkers11. De generatie van ROS vertegenwoordigt een van de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen na fagocytose11. Recente studies hebben aangetoond dat een netachtige structuur die vrijkomt door een neutrofiel genaamd neutrofiele extracellulaire val (NET) ook betrokken is bij het bacteriedodingsproces6,11,12.
Er is gemeld dat ROS geproduceerd door neutrofielen geïnduceerd door de stimulatie van pathogene micro-organismen voornamelijk wordt veroorzaakt door de activering van NADPH-oxidase, dat bestaat uit twee membraanbindende subeenheden (gp91phox en p22phox) en drie cytosolische subeenheden (p47phox, p67phoxen p40phox)5. De overspoelde bacteriën activeren een reeks kinases in de neutrofielen, zoals eiwitkinase C (PKC), eiwitkinase A (PKA) en mitogen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK), die de cytosolische subeenheden p47phox van NADPH-oxidase fosforylaat. Vervolgens een cytosolic trimer samengesteld uit p47phox, p67phox, en p40phox translocates naar het membraan te combineren met de membraan bindende subunit gp91phox en p22phox, het vormen van de volledige NADPH oxidase complex. Het geassembleerde NADPH-oxidasecomplex brengt NADPH-afgeleide elektronen over naar moleculair O2, genereert superoxide-anionen en activeert de bacteriedodende functies13,14,15. Er wordt ook gemeld dat ROS geproduceerd door neutrofielen ook geassocieerd kan worden met de NETTO-vorming van neutrofielen16,17. Daarom zou de detectie van ROS-productie bijdragen aan de verdere studie van het bacteriedodende mechanisme van neutrofielen.
In dit protocol worden de neutrofielen geïsoleerd uit perifeer bloed voorgeladen met fluorescentiesonde DHE en toegewezen aan een 96-put zwarte polystyreen microplaat. De ROS-intensiteit wordt in realtime gedetecteerd door een microplaatlezer nadat meningitische Escherichia coli is toegevoegd.
Het verzamelde bloed wordt gecoaguleerd met behulp van EDTA of citraat om activering van neutrofielen te voorkomen door complement18. Aangezien neutrofielen terminaal gedifferentieerd zijn en een korte levensduur (ongeveer 4-8 uur) in het circulerende bloed hebben, moeten de isolatiestappen zo snel mogelijk na bloedafname worden uitgevoerd19. Veel isolerende reagentia, zoals Ficoll-Hypaque en Percoll, zijn gebruikt om neutrofielen te isoleren uit perifeer bloed11,19,20. In dit protocol worden neutrofielen geïsoleerd door CD16 microbeadselectie na erytrocytenlyse uit het perifere bloed. Het biedt aanzienlijke verbeteringen in snelheid, eenvoud en zuiverheid. Om zuiverdere neutrofielen te verkrijgen, kon een dichtheidsgradiëntcentrifugatie vóór de isolatie met CD16 magnetische parels worden toegepast.
Een aantal erkende fluorescerende sondes, zoals dihydroethidium (DHE), 2', 7'-dichloorodiehydrofluoresceïnediacetaat (H2DCF-DA) en dihydrorhodamine 123 (DHR) die vrij door het celmembraan gaan, kunnen worden gebruikt voor de bepaling van intracellulair ROS door flowcytometrie, confocale microscopie of microplaatlezer21,22,23,23. Naast de detectie van DHE fluorescentiesonde met microplaatlezer, kunnen flowcytometrie en confocale microscopie ook worden gebruikt om de veranderingen van fluorescentie-intensiteit van DHE op de aangegeven tijdstippen te detecteren om de ROS-productie bij neutrofielen te meten.
Dit protocol biedt een eenvoudigere manier voor de detectie van ROS-productie in realtime en kan in verschillende scenario's worden gebruikt om de ROS-generatie te detecteren in cellen van gastzoogdieren die zijn geïnfecteerd met pathogene micro-organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) en het Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S.
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J.
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S.
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
