Summary
Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.
Abstract
Een enkele cardiomyocyt is een essentieel hulpmiddel in de cellulaire en subcellulaire niveaustudies van cardiale biologie en ziekten als een fundamentele eenheid van contractie en elektrische activiteit. Daarom is het isoleren van levensvatbare, hoogwaardige cardiomyocyten uit het hart de eerste en meest cruciale experimentele stap. Door de verschillende protocollen voor het isoleren van de cardiomyocyten van volwassen muizen te vergelijken, is de Langendorff retrograde perfusie de meest succesvolle en reproduceerbare methode die in de literatuur wordt gerapporteerd, vooral voor het isoleren van ventriculaire myocyten. Het isoleren van kwaliteits-atriale myocyten uit het doordrenkte hart blijft echter een uitdaging en er zijn weinig succesvolle isolatierapporten beschikbaar. Het oplossen van dit gecompliceerde probleem is uiterst belangrijk omdat naast ventriculaire ziekte, atriale ziekte verantwoordelijk is voor een groot deel van de hartaandoeningen. Daarom is verder onderzoek op cellulair niveau om de mechanismen te onthullen gerechtvaardigd. In dit artikel wordt een protocol geïntroduceerd op basis van de Langendorff retrograde perfusiemethode en werden tegelijkertijd enkele wijzigingen aangebracht in de diepte van aortacannulatie en de stappen die het verteringsproces kunnen beïnvloeden om atriale en ventriculaire myocyten te isoleren. Bovendien is bevestigd dat de geïsoleerde cardiomyocyten vatbaar zijn voor patchklemonderzoek.
Introduction
Hartziekten zijn een van de belangrijkste wereldwijde doodsoorzaken1. Om deze last voor het gezondheidszorgsysteem aan te pakken, is een diepgaand begrip van de fysiologie en pathologie van het hart essentieel. Naast het hele dier en intacte hartvoorbereiding, is cellulaire voorbereiding een ander onmisbaar hulpmiddel voor functionele en ziektestudie2. Door de patchklem, calciumbeeldvorming, moleculaire biologie en andere geavanceerde technologieën toe te passen, kunnen onderzoekers meer informatie verkrijgen over de elektrofysiologische eigenschappen, calciumhomeostase, signaalroutes, metabole toestanden en gentranscripties in een enkele cardiomyocyt (CM). Dit is uiterst nuttig bij het onthullen van de fysiologische en pathologische mechanismen van het hartziekteproces3,4,5,6,7. Voor dieronderzoek kunnen soorten variërend van kleine (bijv. Muizen, ratten en cavia's) tot grote (bijv. Konijnen en honden) dieren worden gebruikt. Kleine dieren hebben meestal de voorkeur, met name muizen, omdat ze vatbaar zijn voor manipulatie van genetische en ziektemodellen8,9,10.
Technieken van acuut geïsoleerde CM's hebben een lange ontwikkelingsperiode doorgemaakt en zijn nog steeds in ontwikkeling11. De Langendorff retrograde perfusie is de meest succesvolle en reproduceerbare CMs-isolatiemethode die wordt toegepast bij ratten en muizen, vooral voor het isoleren van ventriculaire myocyten (VM's)12,13,14,15. Meldingen van succesvol geïsoleerde atriale myocyten (AM's) zijn echter schaars16,17,18. Verder onderzoek op beide niveaus van het hele orgaan/systeem en het cellulaire/subcellulaire om de mechanismen te onthullen en nieuwe therapeutische benaderingen te verkennen, is gerechtvaardigd omdat atriumfibrilleren (AF), het meest voorkomende type aritmie, wereldwijd steeds vaker voorkomt en de huidige behandelingsmodaliteiten in zowel farmacologische therapieën als hartablatie niet effectief blijven bij ongeveer 40% -50% van de AF-patiënten19 . Succesvolle isolatie van cm's voor volwassen muizen is de eerste stap voor cellulair onderzoek. Er kunnen twee primaire isolatiemethoden worden gebruikt: de chunk- en Langendorff-methoden. Bij de Langendorff-perfusiemethode is de weefselvertering afhankelijk van de enzymoplossing die door de kransslagaders en hun takken aan de capillaire bedden wordt geleverd. Een goede aorta-cannulatiediepte die kan voorkomen dat de aortakleppen binnendringen en de coronaire ostia blokkeren, is de voorwaarde voor het bereiken van een dergelijk perfusiepatroon, wat ook de essentiële stap is voor een efficiënte spijsvertering en ideale VM-opbrengst. Daarom is het redelijk om aan te nemen dat de diepte van de aortacannulatie op dezelfde manier de perfusie van het atriavat kan beïnvloeden en uiteindelijk de AM-opbrengst kan beïnvloeden. Om deze hypothese te testen, werd aorta cannulatie op verschillende diepten uitgevoerd en werden de bijbehorende AM-opbrengsten vergeleken. De gegevens toonden aan dat de aorta cannulatiediepte direct relevant is voor de AM-opbrengst. Hierin wordt een protocol geïntroduceerd om AM's en VM's tegelijkertijd te isoleren.
Protocol
Volwassen mannelijke C57BL /6-muizen met een gewicht van 20-30 g, 8-10 weken oud werden gekocht bij het Animal Centre van Capital Medical University, Beijing, China. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Capital Medical University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren voorgesteld door het Institute of Animal Resources en gepubliceerd door de National Institutes of Health. Excel en Origin 8.5 werden gebruikt voor data-acquisitie en -analyse. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD, voor statistische evaluatie werd de Student's t-test gebruikt en P < 0,05 als statistisch significant werd beschouwd.
1. Bereiding van oplossings- en perfusieapparatuur
- Monteer een Langendorff-apparaat met constante stroom (in de handel verkrijgbaar of zelfgemaakt). Figuur 1 geeft een eenvoudig schema.
- Bereid de oplossingen volgens de reagentia in tabel 1 en tabel 2.
- Schakel het circulerende waterbad in en stel een geschikte ingangstemperatuur in (42,7 °C in ons laboratorium) om ervoor te zorgen dat de uitstroom van het perfusaatcirculatiesysteem uit de canule 37 °C bereikt.
- Reinig het perfusiesysteem door gedeïoniseerd water te laten circuleren. Als een steriele toestand vereist is, laat dan 75% ethanol gedurende 15 minuten door het perfusiesysteem lopen, gevolgd door gedeïoniseerd water (ten minste 10 cycli om alcoholtoxiciteitseffecten op het hart te voorkomen).
- Meet de tijd en het volume voor één cyclus van het perfusaatcirculatiesysteem om te bepalen hoeveel milliliter zuurstofhoudende Tyrode-oplossing in de volgende perfusiestap moet worden geladen.
- Steriliseer alle chirurgische hulpmiddelen op de gewenste methode.
- Stel het debiet van het perfusaatperfusiesysteem in op 4 ml/min.
- Bereid twee schone petrischalen van 35 mm- een met de oplossing van Tyrode (petrischaal 1), de andere met oplossing 1 (petrischaal 2).
- Bereid een spuit van 1 ml gevuld met oplossing 1 en een 20 G stompe stalen canulenaald met een inkeping van waar de afstand 1 mm tot de punt is. Bereid een losse knoop voor met 3-0 hechting aan de canuleschacht. Regel het kijkveld van de stereomicroscoop en zorg ervoor dat de canulepunt zich onder het vloeistofoppervlak van petrischaal 2 bevindt.
2. Dierlijke bereiding
- Dien heparine (concentratie, 1.000 IE / ml; 0,2 ml / muis) intraperitoneaal toe aan de muizen om bloedstolsels te voorkomen. Verdoof de muizen na 10 minuten met natriumpentobarbital (50 mg/kg, IC-injectie) en zorg ervoor dat de muizen niet meer reageren op staart/teenknijpen. Voer cervicale dislocatie uit 20 minuten na toediening van heparine.
- Breng de muizen over op het chirurgische platform, fixeer de muizen in rugligging, steriliseer de borst met 75% ethanol en droog het met gaas of servet.
3. Hartexcisie en aorta cannulatie
- Til de huid van de xiphoid op met een weefseltang en maak een kleine laterale incisie door de huid met een weefselschuiver. Voer een stompe dissectie uit tussen de huid en fascia en verleng de incisie van de huid in een V-vorm naar de oksel aan beide zijden.
- Ga door met hetzelfde incisiespoor door de ribbenkast en buig vervolgens de ribbenkast naar boven af door het borstbeen met een weefseltang vast te klemmen om het hart en de longen volledig bloot te leggen.
- Pel het hartzakje af met een gebogen tang. Scheur de thymus naar beide zijden met twee gebogen tangen als deze de grote vaten bedekt. Trek voorzichtig de basis van het hart naar de staart met een gebogen tang totdat een "Y"-vormig bloedvat (de aorta en zijn takslagaders) te zien is.
- Om verschillende lengtes van de aorta te reserveren voor cannulatie en vergelijking, transecteert u de aorta bij de linker gemeenschappelijke halsslagader (groene lijn in figuur 2) en snijdt u de brachiocephalische slagader tegelijkertijd door bij sommige muizen. Transect bij de opgaande aorta bij andere muizen (zwarte lijn in figuur 2).
OPMERKING: Voor degenen die nieuw zijn in deze procedure, kan deze stap ook worden uitgevoerd onder een stereoscopische microscoop. - Snijd het hart weg en dompel het onmiddellijk onder in petrischaal 1 om het resterende bloed te wassen en weg te pompen.
- Breng het hart over naar petrischaal 2 en knip eventueel overtollig weefsel bij met een fijne irisschaar. Voor degenen die nieuw zijn in deze procedure, doe deze stap onder de stereomicroscoop om te voorkomen dat de aorta of andere hartstructuren ten onrechte worden doorgesneden.
- Druk op de spuit om luchtbellen te verdrijven voordat de aorta kan worden gecanuleerd. Voer retrograde aorta cannulatie uit met behulp van twee rechte bindtangen (gladde kaken) onder de stereomicroscoop. Zorg ervoor dat het hele cannulatieproces zich onder het vloeistofoppervlak bevindt.
- Vermijd het binnendringen van de aortakleppen en pas de diepten aan op respectievelijk de opgaande aorta (de muis die de aorta werd getranssneden in de linker gemeenschappelijke halsslagader) en de aortawortel (de muis die de aorta werd getransecteerd bij de opgaande aorta).
OPMERKING: De diepte van aorta cannulatie (eenvoudigweg aangeduid als diepte) wordt hier gedefinieerd als de positie waar de canulepunt zich in de aorta bevindt of waar de aorta is geligeerd. - Ligging de aorta met de voorknoop 3-0 hechting aan de canule-inkeping. Druk voorzichtig op de inhoud van de spuit om het resterende bloed te spoelen.
OPMERKING: Het bloed zal de kransslagaders verlaten en uit de dorsale aderen komen als de diepte goed is gepositioneerd. Het hart en de atriale aanhangsels zullen uitzetten en bleek worden. - Verwijder de canule en sluit deze aan op het Langendorff-apparaat. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het hart komen.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de tijd van thoracotomie tot initiële perfusie niet langer mag zijn dan 5 minuten.
4. Hartperfusie
- Eerst primen en perfuseren de zuurstofrijke Tyrode-oplossing gedurende ongeveer 10 s (het vloeistofvolume van 10 s in het systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is ongeveer 0,7 ml) als er restbloed in de boezems is, en schakel dan over naar oplossing 1. Echter, gewoon perfuseren met oplossing 1 Als er geen restbloed in de boezems zit. Laat het hart ongeveer 2 minuten doordringen.
- Schakel over naar oplossing 3. Zuig ongeveer 2,5 ml oplossing 3 met een steriel polyethyleenpipet voor eenmalig gebruik en verwarm het voor in het waterbad voor later gebruik, terwijl de rest ongeveer 11-12 minuten voor perfusie wordt gebruikt. Gooi oplossing 3 geperfuseerd in de eerste 2 min weg. Recycle de rest naar de perfusaatreservoirs door de peristaltische pomp voor hergebruik totdat de spijsvertering is voltooid.
- Beëindig de spijsvertering wanneer het hart gezwollen raakt en enigszins bleek en slap wordt (sponsachtige textuur) of er een afdruk bestaat als het myocard voorzichtig wordt geknepen met behulp van een getande tang.
5. Celisolatie en calciumherintroductie
- Verwijder de ventrikels en de boezems met een tang en plaats ze in verschillende petrischalen. Voeg de voorgewarmde oplossing 3 toe aan de petrischaaltjes.
- Trituraleer het weefsel tot een troebele textuur met stompe tang en pipetteer het weefsel voorzichtig voor een gelijkmatige spijsvertering. Vermijd het introduceren van luchtbellen.
- Breng het troebel verteerde weefsel met de pipet over in oplossing 4 om de resterende enzymactiviteit te stoppen en centrifugeer vervolgens gedurende 20 s bij 192×g. Verwijder het supernatant en voeg oplossing 5 toe aan het celsediment en pipetteer om de cellen gelijkmatig te verspreiden.
- Herintroduceer calcium stapsgewijs om calciumparadox en calciumoverbelasting te voorkomen. Voeg geleidelijk een totaal van 50 μL 100 mM/L CaCl2 (bij elk interval van 5 minuten van respectievelijk 5 μL, 10 μL, 15 μL en 20 μL) toe aan de celsuspensie.
6. Celopslag
- Bewaar de cellen voor het patchklemonderzoek in de oplossing van Tyrode. Voor andere cellulaire studies, bewaar de cellen in oplossing 6.
- Om de nauwkeurigheid van de resultaten van acute functionele studies (bijv. Ca2+ vonken, Ca2+ golven, Ca2+ release, Ca2+ lek en patchklem opnames) te garanderen, moet u dit soort functionele experimenten binnen de volgende 6 uur voltooien.
Representative Results
Dit papier, waarbij de canulepunt in de aorta is geplaatst, die wordt gedefinieerd als de diepte van aorta-cannulatie (eenvoudigweg diepte genoemd), geeft ook aan waar de aorta is geligeerd. De AM en VM geïsoleerd uit een hart dat werd gekannuleerd en geligeerd bij de opgaande aorta worden weergegeven als respectievelijk AMAA en VMAA. Bovendien worden AM en VM geïsoleerd uit een hart dat was gekannuleerd en geligeerd bij de aortawortel weergegeven als respectievelijk AMAR en VMAR. Figuur 2 toont het overzicht van de aorta en de transsectieposities. Figuur 3 toont ook de diepten en de ligatieplaatsen die overeenkomen met de aorta-transsectieposities. Diepte werd geassocieerd met de perfusie van de boezems en atriale aanhangsels. Beide atriale aanhangsels worden opgeblazen wanneer de canulepunt zich bij de oplopende aorta bevindt, wat wijst op voldoende atria-perfusie. Bij de aortawortel is de atriaperfusie echter onvoldoende en worden beide atriale aanhangsels gewisteneerd (figuur 4). De CM-morfologie en levensvatbaarheid die na herintroductie van calcium op verschillende diepten worden geïsoleerd uit de gecannuleerde harten (figuur 5). Celmorfologieën van AMAA, AMAR, VMAA en VMAR liggen onder de confocale microscoop voor en na de herintroductie van calcium. AM's zijn spilvormig, terwijl VM's staafvormig zijn met rechthoekige uiteinden. Bovendien hebben AM's en VM's intacte membranen, duidelijke contouren, duidelijke dwarsgestreepte sarcomeren en een glad oppervlak (figuur 6). De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld via trypan blue staining. Normale cellen met intacte membranen kunnen trypanblauw uitsluiten en zullen niet worden gekleurd, terwijl cellen die activiteit verliezen intracellulair snel trypanblauw accumuleren (figuur 7). AM's en VM's werden in verschillende objectdia's geplaatst om celtelling uit te voeren. De totale opbrengst van AM en het percentage levensvatbare spindelvormige CM's (overlevingskans) werden bepaald door 10 μL van de celsuspensie over te brengen naar een objectglijden en geteld onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop bij 4 × 10 gezichtsvelden. Dezelfde methode werd gebruikt om de totale opbrengst van VM's (staafvormig) en het percentage levensvatbare VM's te bepalen. Deze methode heeft de voorkeur boven het gebruik van een hemocytometer, omdat de CM's zich vanwege hun grootte en vorm niet gemakkelijk in het telgebied van de hemocytometer verdeelden. Een staafdiagram (figuur 8) toont de overlevingskansen van AMAA, AMAR, VMAA en VMAR voor en na de herintroductie van calcium. Elke waarde vertegenwoordigt de gemiddelde ± SD van 10 muizen. Vóór de herintroductie van calcium zijn de overlevingskansen van AMAA significant hoger dan die van AMAR (respectievelijk 70,9% ± 2,8% en 41,0% ± 5,2%; p < 0,01). Na herintroductie van calcium zijn de overlevingskansen van AMAA significant hoger dan die van AMAR (respectievelijk 69,4% ± 3,0% en 37,7% ± 4,9%; p < 0,01).
De VMAA-overlevingskansen verschilden niet van die van de VMAR (respectievelijk 89,5% ± 2,7% versus 88,1% ± 2,6%; p > 0,05) vóór de herintroductie van calcium. Evenzo verschilden de VMAA-overlevingspercentages niet van die van de VMAR (respectievelijk 82,2% ± 1,9% versus 82,9% ± 1,6%; p > 0,05) na herintroductie van calcium.
Een hart gecannuleerd op diepte zoals dit protocol aanbeveelt (bij de oplopende aorta), een levensvatbare VM's en AM's leveren respectievelijk ongeveer 4,1 miljoen en ongeveer 180.000 op na herintroductie van calcium. De hele-cel patchklemregistratie van de natriumstroom (figuur 9A, B) en stroomdichtheden (figuur 9C) in de geïsoleerde AM en VM bevestigen dat de celkwaliteit heeft voldaan aan de eisen voor elektrofysiologische experimenten. De anatomie van de aorta (figuur 10) laat zien dat het ostium van het boezemvat zich in de buurt van de aortawortel bevindt en grenst aan het ostium van de kransslagader (CA). Tabel 3 toont de afstand van de canulepunt tot het CA ostium van harten gecannuleerd en geligeerd bij respectievelijk de opgaande aorta en de aortawortel.
Figuur 1. Schematisch diagram van een geassembleerd gemodificeerd Langendorff-systeem. Dit systeem is economisch en draagbaar voor de gebruikers. Het heeft twee delen van plastic buizen - een voor het water (binnendiameter, 8 mm) en een voor het perfusaat (binnendiameter, 1,5 mm) - waarvan het distale uiteinde is verbonden met een PE medische driewegstopkraan met een Luer-slot. Een glazen fles met water en met een rubberen stop vormen zich als warmtewisselaar. Het perfusaat wordt door de peristaltische pomp in de plastic buis in de warmtewisselaar gepompt en komt uit de driewegstopkraan die op de canule is aangesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Aorta en tissues rond. Een "Y"-vormige bloedvatstructuur is de aorta en zijn takken: de brachiocephalische slagader (pijl 1) en de linker gemeenschappelijke halsslagader (pijl 2). Transect de aorta tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader (groene lijn) en snijd tegelijkertijd de brachiocephalische slagader bij sommige muizen; transect bij de opgaande aorta (zwarte lijn) bij andere muizen (stereomicroscoop 10 × 2 vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Frontaal zicht op het gecannuleerde hart. De zwarte gebogen lijn vertegenwoordigt de snijrand van de aorta die werd doorsneden tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader. De rode gebogen lijn vertegenwoordigt de incisale rand van de aorta getranssneden bij de opgaande aorta. De rechte lijn geeft aan waar de aorta werd geligeerd: zwart bij de opgaande aorta en rood bij de aortawortel (stereomicroscoop 10 × 2 vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Perfusietoestand van de gecannuleerde harten. De boezems zijn voldoende doordrenkt en beide atriale aanhangsels worden opgeblazen in het hart (A) gecannuleerd en geligeerd bij de opgaande aorta. Beide atriale aanhangsels zijn echter gewiste in het hart (B) gecannuleerd en geligeerd bij de aortawortel, wat wijst op slechte atria-perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Celmorfologie en levensvatbaarheidsevaluatie na herintroductie van calcium. AM's (A) en VM's (B) geïsoleerd van het hart gecannuleerd en geligeerd bij de opstijgende aorta worden respectievelijk weergegeven als AMAAs en VMAAs. AM's (C) en VM's (D) geïsoleerd uit het hart gecannuleerd en geligeerd bij de aortawortel worden weergegeven als respectievelijk AMARs en VMARs. Hoogwaardige CM's zijn rustig en hebben intacte membranen, duidelijke contouren, heldere dwarsgestreepte sarcomeren en een glad celoppervlak. AM's zijn spilvormig, terwijl VM's staaf- of baksteenvormig zijn met rechthoekige uiteinden. CM's die spontaan samentrekken of blebs in het membraan bevatten, zijn van slechte kwaliteit en degenen die krimpen tot een bolvorm zijn dode cellen. Een willekeurig gezichtsveld (fluorescentiemicroscoop, 10 × 10 vergroting; schaalbalken, 100 μm). AM = atriale myocyt, VM = ventriculaire myocyt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Celmorfologie onder een confocale microscoop voor en na de herintroductie van calcium. Vóór de herintroductie van calcium zijn AMAA (A) en AMAR (C) spindelvormig met duidelijke contouren, dwarsgestreepte sarcomeren en gladde membraanoppervlakken. Na herintroductie van calcium zijn AMAA (B) en AMAR (D) ook spindelvormig met duidelijke contouren, dwarsgestreepte sarcomeren en gladde membraanoppervlakken. Vóór de herintroductie van calcium zijn VMAA (E) en VMAR (G) staaf- of baksteenvormig met duidelijke contouren, striatesarcoeren en gladde membraanoppervlakken met rechthoekige uiteinden. Na de herintroductie van calcium zijn VMAA (F) en VMAR (H) ook staaf- of baksteenvormig met duidelijke contouren, dwarsgestreepte sarcomeren en gladde membraanoppervlakken met rechthoekige uiteinden (confocale microscoopolie, 63 × 10 vergroting; schaalstaven, 50 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen. Beschadigde cellen die activiteit verliezen, worden gekleurd door trypan blauw. Levensvatbare cellen kunnen daarentegen niet worden gekleurd door trypanblauw (fluorescentiemicroscoop, 4 × 10 vergroting; schaalstaven, 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Staafdiagram met de overlevingskansen van AMAA, AMAR, VMAA en VMAR voor en na de herintroductie van calcium. CR = calciumherintroductie. Elke waarde vertegenwoordigt de gemiddelde ± SD van 10 muizen. p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Inhoud (eindconcentratie in mmol/l, indien niet anders gespecificeerd) | Opgemerkt |
| Perfusieoplossing (oplossing 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurine, 5 Glucose, 10 2,3-butanedione monoxime(BDM) | Deze kan 3 dagen bewaard worden bij 4 °C. Glucose, Taurine en BDM worden toegevoegd op de dag van het experiment. Bereid 200 ml perfusieoplossing voor elk hart. |
| De oplossing van Tyrode (oplossing 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glucose | Deze kan 3 dagen bewaard worden bij 4 °C. CaCl2 en Glucose worden toegevoegd op de dag van het experiment, stel de pH in op 7,3-7,4 met verzadigde NaOH bij kamertemperatuur (28-30 °C) met een PH-meter. |
Tabel 1. Oplossingen voor CM-isolatie van volwassen muizen.
| Oplossing | Inhoud | Opgemerkt |
| Digestieoplossing(oplossing 3) | 25 ml oplossing 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg collagenase II, 50 μL (2,5 % 10×) trypsine | voor elk hart |
| Stop oplossing 1(oplossing 4) | 9 ml oplossing 1, 1 ml FBS (foetaal runderserum), 4 μl 100 mM/l CaCl2 | voor elk hart |
| Stop oplossing 2(oplossing 5) | 9,5 ml oplossing 1, 0,5 ml FBS (foetaal runderserum), 4 μl 100 mM/l CaCl2 | voor elk hart |
| Oplossing voor celreuspensie(oplossing 6) | 13 ml oplossing 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) in een dosis die een dunne laag kan vormen die het oppervlak van de vloeistof bedekt | voor elk hart |
Tabel 2. Oplossingen voor CM-isolatie en opslag voor volwassen muizen.
Figuur 9. Stroom-spanningscurven van de natriumkanalen. Whole-cell patch clamp-technieken werden gebruikt om natriumstromen van de geïsoleerde cardiomyocyten in de spanningsklemmodus te registreren. Het spanningklemprotocol wordt weergegeven in de inzet. Natriumstromen geregistreerd van de AM (A) en VM (B) worden weergegeven. De huidige dichtheden bij potentialen van respectievelijk −45mV, −40mV en −35 mV zijn significant hoger in AM (−32,71 ± respectievelijk 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF en −29,34 ± 1,939 pA/pF; n = 10) dan in VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF en −21,86 ± 1,381 pA/pF; n = 8; P < 0,05). (C) De I-V-curven tonen de natriumstroomdichtheden die werden genormaliseerd tot celcapaciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. Oorsprong en verspreiding van het boezemvat. Het atriale vat (pijl 1) en de CA (pijl 2) in paneel A. Paneel B is een nadere blik op het atriale vat (pijl 3). (C) Er bestaan twee ostia van verschillende grootte; één (pijl 4) komt overeen met het atriale vat dat de atriale aanhangsels irrigeerde, en de andere (pijl 5) komt overeen met de CA (stereomicroscoop 10 × 5 vergroting). CA = kransslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Het serienummer van de muizen | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| De diepte van aorta cannulatie is bij de opgaande aorta | 0.5 | 0.6 | 0.3 | 0.4 | 0.8 | 0.3 | 0.8 | 0.7 | 0.5 | 0.7 | ||
| De diepte van aorta cannulatie is bij de aorta wortel | 0.2 | -0.1 | 0.1 | 0 | -0.1 | 0.1 | -0.2 | 0 | -0.1 | 0 | ||
Tabel 3. Afstand van de canulepunt tot de coronaire ostium. De harten van C57BL/6 muizen (n = 20) werden gebruikt om de aorta te cannuleren en ligaat op diepten van respectievelijk de opgaande aorta en de aortawortel. De aorta wordt geanatomiseerd en de afstand van de canulepunt tot het CA ostium werd gemeten. De afstand wordt gemeten in millimeters en positieve of negatieve tekens vertegenwoordigen respectievelijk de canulepunt boven en onder het CA ostium.
Discussion
Single CM is een waardevol en onmisbaar hulpmiddel in cellulaire niveau studies van hartfunctie en ziekten20. Daarom is de isolatie van levensvatbare CM's van de harten de eerste en meest cruciale stap. Celkwaliteit is een van de belangrijke determinanten van het uitvoeren van succesvolle experimenten, vooral in optische en elektrofysiologische experimenten. In vergelijking met de CM's van andere dieren zijn Knaagdier-CM's kwetsbaarder voor ischemie en hypoxie vanwege een hogere concentratie intracellulaire natriumionen, wat de calciuminstroom via de Na + / Ca2 + -wisselaar21 bevordert. Bovendien is het aantal AM's veel kleiner dan dat van VM's; succesvolle isolatie is dus uiterst moeilijk te bereiken. De Langendorff-methode is uitstekend voor het isoleren van muizen-VM's22, maar het slagingspercentage bij het isoleren van AM's is laag en er zijn weinig rapporten beschikbaar. De juiste diepte van aorta-cannulatie is ook een essentiële factor bij het produceren van ideale VM's, afgezien van temperatuur, enzymactiviteit, PH en waterkwaliteit die worden gebruikt voor buffervoorbereiding. Het principe van de Langendorff-methode is gebaseerd op retrograde perfusie van het hart. Bij perfusie is de aortaklep gesloten; daardoor wordt het perfusaat in de kransslagaders geperst, waarbij enzymoplossing door de vaattakken wordt afgeleverd en het myocardiale weefsel gelijkmatig wordt verteerd. Om een dergelijk circulatiepatroon te bereiken, moet de aorta voldoende lengte reserveren voor cannulatie en ligatie, ook de canulepunt mag de aortakleppen niet binnendringen of het CA ostium blokkeren. Het is dus redelijk om te speculeren dat de diepte van aorta-cannulatie ook geassocieerd is met atriaperfusie, die de spijsvertering van de atria en de opbrengsten van AM op een vergelijkbare manier beïnvloedt. Het hier gepresenteerde protocol bevestigde de hypothese en cruciale stappen voor het optimaliseren van de celopbrengst samen met de suggesties worden hieronder vermeld.
In stap 1.9, om de aorta beter vast te zetten, wordt een stompe canule van 20 G aanbevolen met een inkeping (of een omtrekgroef) van waaruit de afstand 1 mm tot de punt is. Op basis van onze ervaringen bleek de canulegrootte die iets groter is dan de diameter van de aorta te voorkomen dat de canulepunt de aortakleppen doorboort tijdens de cannulatie, omdat de aorta, afhankelijk van zijn intrinsieke elasticiteit, goed in de canule kan passen en wrijving kan produceren, wat fungeert als een beschermende factor bij het vooruit of achteruit bewegen van de cannulatiediepte. In termen van de positie van de inkeping zal het hart gemakkelijk afglijden tijdens de cannulatie vanwege de zwaartekracht als het te dicht bij de canulepunt is. Omgekeerd zal de ruimte voor het aanpassen van de cannulatiediepte en ligatiepositie zeer beperkt zijn als deze te ver is. Gezien deze omstandigheden is het beter om de aorta tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader (zoals de groene lijn in figuur 2) te transeceren om ervoor te zorgen dat de aorta lang genoeg is en kan worden gecannuleerd en geligeerd bij de opgaande aorta in stap 3.3. Terwijl transecting bij de opgaande aorta, de gereserveerde lengte voor cannulatie op zijn minst de canulepunt dicht bij de aortawortel zou kunnen beveiligen en na ligatie niet in de aortakleppen zal doordringen. De anatomie van de aorta en de meting van de afstand van de canulepunt tot het CA ostium geven aan dat het transeceren van de aorta tussen de linker gemeenschappelijke halsslagader een ideale positie is om een goede aorta cannulatiediepte te bereiken.
Cannulatiediepte bleek geassocieerd te zijn met de perfusie van de boezems, die op zijn beurt fungeert als een diepte-indicator. Figuur 4 laat zien dat de atriaperfusie goed is wanneer de diepte bij de opgaande aorta ligt en beide atriale aanhangsels zijn opgeblazen. Atriaperfusie is echter onvoldoende wanneer de diepte bij (of in de buurt van) de aortawortel ligt en beide atriale aanhangsels zijn gewizened. De totale en levensvatbare telling van AM die werd verkregen uit de opgeblazen atriale aanhangsels was hoger (figuur 8). Deze bevindingen geven aan dat de cannulatiediepte van de aorta de perfusie en vertering van de boezems en atriale aanhangsels op een bepaalde manier kan beïnvloeden en uiteindelijk de AM-opbrengst en -kwaliteit kan beïnvloeden. De opbrengst en kwaliteit van AM werden afgeleid in verband met de verdeling van de vaten die de boezems bevoorraden. De studie van Fernández et al.23 heeft verschillende anomalieën aangetoond in de oorsprong en het verloop van muis CA. Ze ontdekten dat de CA's ostia zeer variabel waren en zich niet allemaal in de aorta-sinus bevonden. Sommige CA's kunnen abnormaal van boven de aortabijholten ontstaan, het hoge take-off ostium genoemd. Sommige CA's kunnen afkomstig zijn van dezelfde aorta-sinus en het ostium van het atriumvat is net in de buurt. De anatomie van de aorta in deze studie (figuur 10) komt ook overeen met de bevinding van Fernández. Dit kan de oorzaak zijn waarom pogingen om AM te isoleren volgens de Langendorff-methode grotendeels zijn mislukt als de cannulatiediepte niet geschikt is. De canulepunt heeft dus een grotere kans om het atriumvat ostium dat grenst aan het CA ostium te blokkeren als er niet genoeg ruimte beschikbaar is tussen de canulepunt en het CA ostium. Daarentegen werden de perfusie en celopbrengst van de ventrikel nauwelijks beïnvloed zolang de aortakleppen niet door de canulepunt werden gepenetreerd. Dit komt waarschijnlijk omdat de CA's die bloed leveren aan de ventrikel grotere ostia en meer oorsprong hebben. Als een ostium werd afgesloten door de canule, kan ventrikelperfusie worden gecompenseerd door een andere CA of de collaterale circulatie, terwijl het bloedvat dat het atrium voedt vrij klein is en geen vervanging heeft. De invloed van de diepte in aorta cannulatie is dus belangrijk.
Andere opmerkelijke factoren en probleemoplossingen in het verterings- en celopslagproces worden als volgt vermeld. Overweeg eerst om de oplossing van zuurstofhoudende Tyrode in stap 4.1 te perfuseren om de spier te laten samentrekken en restbloed weg te pompen als het bloed in de boezems niet is gehaast na aortaligatie. Dit kan helpen het nadelige effect van ca2 + en andere materialen die vrijkomen uit de beschadigde erytrocyten te voorkomen. Ten tweede kan het vooraf doordrenken van ca2+-vrije oplossing om de verbinding te dissociëren en de ruimte tussen cellen uit te breiden de werkzaamheid van enzymvertering verbeteren, omdat geïncaleerde schijven tussen CM's calciumafhankelijke intercellulaire juncties zijn. De tijd moet echter worden beperkt tot 3-5 minuten om het calciumparadoxfenomeen te voorkomen24. Een gemengde enzymoplossing wordt aanbevolen. Collagenase type II verstoort het extracellulaire matrixnetwerk en trypsine helpt het korrelige materiaal dat op het celoppervlak achterblijft te verwijderen als collagenase II-vertering onvolledig is. Dit zorgt voor een glad celoppervlak, wat van cruciaal belang is voor het vormen van een GΩ-afdichting in de patchklemregistratie. Niettemin moet de trypsineconcentratie in het juiste bereik worden gecontroleerd om oververtering en celbeschadiging te voorkomen, omdat het het membraaneiwit kan afbreken. Het gebruik van collagenase type II alleen om de celopbrengst te verbeteren, kan vaak leiden tot weefselovergang, en de geïsoleerde CM's zullen calciumintolerantie hebben na langdurige blootstelling aan collagenase25. Het gebruik van 2,3-butanedione monoxime (BDM), een stof die spontane contractie voorkomt door het myosine ATPase te remmen en dwarsbrugvorming te voorkomen, is nog steeds controversieel26,27,28,29. Volgens eerdere ervaring is het toevoegen van BDM noodzakelijk voor dit protocol. Enzymoplossing wordt bereid met oplossing 1, hoewel oplossing 1 geen calcium bevat en calcium wordt toegevoegd om het enzym te activeren. Het voordeel van het toevoegen van BDM in de perfusieoplossing omvat (1) het remmen van de contractie van myocyten en het verminderen van het zuurstofverbruik tijdens perfusie van enzymoplossing en (2) het voorkomen van myocyten van hypoxie en het verbeteren van de kwaliteit van de geïsoleerde myocyten. Sommige studies meldden dat BDM een potentieel nadelige invloed kan hebben op cellulaire elektrische eigenschappen. De resultaten van de hele-cel patchklemregistratie van de natriumstroom wezen echter niet op een ongewenst effect. In de celopslagstap (stap 6) hebben tal van studies gekozen voor de KB-buffer, een calciumvrije maar hoge kaliumconcentratieoplossing, waarin cellen een betere toestand kunnen behouden omdat ze zich in gepolariseerde en lage metabolische omstandigheden bevinden. De glycocalyx van het celmembraan zal echter gedurende een bepaalde tijd scheiden van de lipide bilaag in afwezigheid van exogene calcium en de membraandoorlaatbaarheid zal toenemen, wat de daaropvolgende functionele analyse beïnvloedt30,31,32.
Alle myocytenisolatietechnieken kunnen momenteel in wezen worden onderverdeeld in ofwel brok (een klein stukje weefsel) spijsvertering in een enzymatische oplossing of CA-perfusie met enzymatische oplossing (de Langendorff-perfusie)22. In vergelijking met de Langendorff-methode is de brokkenvergistingsmethode gemakkelijker uit te voeren en wordt deze in veel laboratoria ook routinematig gebruikt voor het isoleren van CM's. Deze methode produceert echter normaal gesproken een lage opbrengst van CM's van slechte kwaliteit uit volwassen weefsels22. Bovendien zijn cellen die met deze methode worden geïsoleerd mogelijk niet geschikt voor het uitvoeren van vergelijkende experimenten. Bijvoorbeeld, bij het testen van de celtype-specifieke geneesmiddeleffecten tussen AM en VM, kan de impact van verschillende isolatieomstandigheden niet worden verwaarloosd of uitgesloten. Dit komt omdat het myocardium en de weefseldichtheid van de ventrikel veel dikker en dichter zijn dan die van het atrium, wat resulteert in verschillende verteringstijden en enzymconcentraties. Bovendien zal overmatige agitatie en pipettering van het weefsel tijdens de spijsvertering de cellen beschadigen en functionele studies aanzienlijk beïnvloeden. Bovendien hebben veel eerdere studies aangetoond dat AM's kwetsbaarder zijn voor calcium. AM's die door het huidige protocol worden geïsoleerd, kunnen echter tolerant zijn voor gradiëntcalciumherintroductie, waarschijnlijk omdat het weefsel aan het einde van het verteringsproces gemakkelijk te scheuren is. Mechanische schade is dus minder, terwijl cellen meer mechanische schade zouden lijden omdat stappen van de brokkenmethode herhaalde breuk en centrifugaal nodig hebben. Meer recent rapporteerden Ackers et al.33 een vereenvoudigde, Langendorff-vrije methode voor de isolatie van levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten. De VM's en de fibroblasten kunnen effectief worden geïsoleerd, maar de hoeveelheid van de AM's werd niet genoemd. Dit protocol heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste kan de verdeling van de hartbloedvaten variaties hebben voor individuele verschillen en muizenstam, en de aanbevolen cannulatiediepte kan geen succesvolle AM-isolatie voor elke keer garanderen. Ten tweede, voor degenen die nieuw zijn in deze procedure kan het een bepaalde hoeveelheid tijd duren om aorta-transsectie en retrograde aorta-cannulatie te oefenen. Ten slotte werd deze methode niet getest in andere modellen voor hartziekten, behalve bij gezonde en oudere muizen. Daarom zal het aanpassingen in enzymconcentraties en tijd van spijsvertering vereisen vanwege de fibrose-omvang van het hart. Het nadeel van verschillende verteringsomstandigheden die bij de brokkenmethode worden aangetroffen, zal geen probleem zijn in de Langendorff-methode waarbij de enzymoplossing gelijkmatig door de vaatbedden over het weefsel wordt verdeeld.
Samenvattend hebben de protocollen voor de gelijktijdige isolatie van enkelvoudige AM en VM die hier worden beschreven, aangetoond dat de juiste aorta-cannulatiediepte de atriumperfusie en AM-opbrengst effectief kan verbeteren. De CMs die door deze methode worden geïsoleerd, zijn van hoge kwaliteit, beschikken over een goede calciumtolerantie en zijn met succes toegepast op patchklemregistratie en calciumbehandeling (Ca2 + release en Ca2 + golfmeting door het IonOptix-systeem) in het team34. Verwacht wordt dat het isolatieprotocol kan worden gebruikt voor celvoorbereiding in een reeks cellulaire en subcellulaire onderzoeken, die zullen helpen het begrip van hartfysiologie en pathologie te verdiepen. Belangrijk is dat het de ontdekking van meer klinisch relevante mechanismen voor hartziekten en interventiemethoden mogelijk maakt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) en de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7192051). Bijdragen van de auteur: Bai en Liu ontwierpen en bedachten het project. Wen en Ruan gaven waardevolle adviezen voor de experimenten. Wu en Linling Li voerden het experimentele werk uit en speelden een sleutelrol in data-acquisitie, analyse en interpretatie. Li nam deel aan de assemblage van het Langendorff-apparaat. Peng, Zhang, Wang en Yang namen deel aan de voorbereiding van de reagentia en oplossingen voor het experiment. Wu schreef het artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
| Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
| Excel | data acquisition and analysis | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
| Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
| Water bath | JULABO | ED (v.2) |
References
- Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
- Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
- Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
- Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
- Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
- Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
- Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
- Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
- Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
- Dobrev, D., Wehrens, X. H. T.
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
- Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
- Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
- Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
- Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).
