Summary
O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.
Abstract
A principal causa de morte no mundo persiste como doença cardiovascular (DCV). No entanto, modelar a complexidade fisiológica e biológica do músculo cardíaco, o miocárdio, é notoriamente difícil de realizar in vitro. Principalmente, os obstáculos residem na necessidade de cardiomiócitos humanos (CMs) que são adultos ou exibem fenótipos adultos e podem replicar com sucesso a complexidade celular do miocárdio e a arquitetura 3D intrincada. Infelizmente, devido a preocupações éticas e falta de tecido cardíaco humano derivado do paciente primário disponível, combinado com a proliferação mínima de CMs, a fonte de CMs humanos viáveis tem sido um passo limitante para a engenharia de tecidos cardíacos. Para isso, a maioria das pesquisas passou para a diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) como a principal fonte de CMs humanos, resultando na ampla incorporação de hiPSC-CMs dentro de ensaios in vitro para modelagem de tecido cardíaco.
Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um dispositivo microfluido. Explicamos e demonstramos visualmente a produção de um modelo 3D in vitro de tecido cardíaco anisotrótrópico de CMs derivados de hiPSC. Descrevemos principalmente um protocolo de purificação para selecionar para CMs, a co-cultura das células com uma razão definida através da mistura de CMs com CFs humanos (hCFs), e suspensão desta co-cultura dentro do hidrogel à base de colágeno. Demonstramos ainda a injeção do hidrogel carregado de células dentro do nosso dispositivo microfluido bem definido, embutido com micropostos elípticos escalonados que servem como topografia superficial para induzir um alto grau de alinhamento das células circundantes e da matriz de hidrogel, imitando a arquitetura do miocárdio nativo. Prevemos que o modelo 3D anisotrópico de tecido cardíaco on-chip é adequado para estudos fundamentais de biologia, modelagem de doenças e, através de seu uso como ferramenta de triagem, testes farmacêuticos.
Introduction
Abordagens de engenharia de tecidos têm sido amplamente exploradas, nos últimos anos, para acompanhar os achados clínicos in vivo na medicina regenerativa e modelagem da doença1,2. A ênfase significativa tem sido particularmente colocada na modelagem in vitro do tecido cardíaco devido às dificuldades inerentes à obtenção do tecido cardíaco primário humano e à produção fisiologicamente relevante substitutos in vitro, limitando a compreensão fundamental dos mecanismos complexos de doenças cardiovasculares (DCV)1,3. Modelos tradicionais têm frequentemente envolvido ensaios de cultura monocamadas 2D. No entanto, a importância de aculturar células cardíacas dentro de um ambiente 3D para imitar tanto a paisagem nativa do miocárdio quanto as complexas interações celulares tem sido amplamente caracterizada4,5. Além disso, a maioria dos modelos produzidos até agora incluiu uma monocultura de CMs diferenciadas das células-tronco. No entanto, o coração é composto por múltiplos tipos de células6 dentro de uma complexa arquitetura 3D7,garantindo a necessidade crítica de melhorar a complexidade da composição tecidual dentro de modelos in vitro 3D para melhor imitar constituintes celulares do miocárdio nativo.
Até o momento, muitas abordagens diferentes foram exploradas para produzir modelos 3D biomiméticos do miocárdio8. Essas abordagens vão desde configurações experimentais que permitem o cálculo em tempo real da força gerada, desde CMs monoculturados em filmes finos (considerados filmes musculosos finos (MTFs))9, até células cardíacas de co-cultura em matrizes de hidrogel 3D suspensas entre cantilevers de pé livre (considerados tecidos cardíacos projetados (EHTs))10. Outras abordagens se concentraram na implementação de técnicas de micromoldagem para imitar a anisotropia miocárdia, desde CMs monocultura em um hidrogel 3D suspenso entre micropostos salientes em um patch de tecido11, até CMs monocultura semeados entre microgrooves recuados12,13. Há vantagens e desvantagens inerentes a cada um desses métodos, portanto, é pertinente utilizar a técnica que se alinha com a aplicação pretendida e a questão biológica correspondente.
A capacidade de melhorar a maturação de CMs derivados de células-tronco é essencial para a engenharia in vitro bem sucedida do tecido miocárdio adulto e tradução de achados subsequentes para interpretações clínicas. Para isso, os métodos para amadurecer CMs têm sido amplamente explorados, tanto em 2D quanto em3D 14,15,16. Por exemplo, estimulação elétrica incorporada em EHTs, alinhamento forçado de CMs com topografia superficial, sinalização, fatores de crescimento da cocultura e/ou condições de hidrogel 3D, etc., tudo leva a uma mudança em favor da maturação de CM em pelo menos um dos seguintes: morfologia celular, manuseio de cálcio, estrutura sarvúrica, expressão genética ou força contratil.
Desses modelos, as abordagens que utilizam plataformas microfluídicas mantêm certas vantagens na natureza, como controle de gradientes, entrada celular limitada e reagentes mínimos necessários. Além disso, muitas réplicas biológicas podem ser geradas de uma só vez usando plataformas microfluídicas, servindo para dissecar melhor o mecanismo biológico de interesse e aumentar o tamanho amostral experimental em favor do poder estatístico17,18,19. Além disso, o uso da fotolitografia no processo de fabricação de dispositivos microfluidos permite a criação de recursos precisos (por exemplo, topografias) no nível micro e nano, que servem como pistas mesoscópicas para melhorar a estrutura celular circundante e a arquitetura tecidual18,20,21,22 para diferentes aplicações na regeneração tecidual e modelagem de doenças.
Anteriormente, demonstramos o desenvolvimento de um novo modelo de tecido cardíaco 3D no chip que incorpora topografia superficial, na forma de micropostos elípticos inatos, para alinhar células cardíacas co-cultivadas por hidrogel em um tecido anisotrópico interconectado20. Após 14 dias de cultura, os tecidos formados dentro do dispositivo microfluido são mais maduros em seu fenótipo, perfil de expressão genética, características de manuseio de cálcio e resposta farmacêutica quando comparados com monocamadas e controles isotrópicos 3D23. O protocolo aqui descrito descreve o método para a criação deste tecido cardíaco humano 3D co-cultivado, alinhado (ou seja, anisotrópico) dentro do dispositivo microfluido usando CMs derivados de hiPSC. Especificamente, explicamos os métodos para diferenciar e purificar hiPSCs em relação aos CMs, suplementação de HCFs com CMs para produzir uma população de cocultura estabelecida, inserção da população celular encapsulada dentro do hidrogel de colágeno nos dispositivos microfluidos e análise subsequente dos tecidos construídos em 3D através de ensaios contratuais e imunofluorescentes. Os microsaússeis projetados em 3D são adequados para várias aplicações, incluindo estudos fundamentais de biologia, modelagem de DCV e testes farmacêuticos.
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Protocol
Realize toda a preparação de manuseio de células e reagentes dentro de um Gabinete de Biossegurança. Assegure-se de que todas as superfícies, materiais e equipamentos que entram em contato com as células são estéreis (ou seja, pulverizar com 70% de etanol). As células devem ser cultivadas em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% de CO2. Toda cultura e diferenciação hiPSC é realizada em placas de 6 poços.
1. Criação de dispositivo microfluido (duração aproximada: 1 semana)
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fotolitografia
NOTA: A máscara, projetada usando o arquivo CAD (fornecido como Arquivo Suplementar 1),contém o desenho do canal microfluido. Imprima o desenho em uma máscara transparente. Em seguida, realize a fotolitografia padrão com o fotoresist negativo SU8 2075 em um wafer de silício de 4 polegadas dentro de uma sala de limpeza.- Limpe um wafer de silício com álcool isopropílico (IPA) e seque com nitrogênio. Asse a 200 °C por 5 minutos para desidratação.
NOTA: Manuseie o wafer com pinças de wafer. - Coloque o wafer no spin-coater. Deposite 3-4 mL de SU8 no centro do wafer, depois gire para formar uma camada de 200 μm (ou seja, aumente de 15 s a 500 rpm, gire por 10 s, aumente de 5 s a 1.200 rpm, e gire por 30 s, depois abaixe para 15 s até parar).
- Retire o wafer e leve ao forno macio por 7 minutos a 65 °C, depois 45 min a 95 °C.
- Mova o wafer para um alinhador de máscaras e coloque a máscara transparente no porta-máscaras com um filtro UV. Exponha o wafer a 2 ciclos de 230 mJ/cm2, com 30 s de atraso, para uma exposição total de 460 mJ/cm2.
- Realize um assado pós-exposição no wafer exposto em um forno de 50 °C durante a noite.
- Desligue o forno na manhã seguinte, e depois que o wafer esfriar à temperatura ambiente, submerse-o em SU8-desenvolvedor. Remova o wafer do desenvolvedor a cada 5 minutos e lave com o IPA e coloque-o de volta no desenvolvedor.
- Depois de cerca de 20 min, ou quando o IPA estiver limpo, seque o wafer com nitrogênio de ar e asse duro em um forno definido a 150 °C; assim que o forno atingir 150 °C, desligue-o, mas não abra. Deixe o wafer no forno até atingir a temperatura ambiente, em seguida, remova o wafer.
- Confirme a altura do SU8 com um perfil e os recursos ópticos com um microscópio leve. Uma vez confirmado, grave o wafer dentro de uma placa de Petri de plástico de 150 mm.
- Limpe um wafer de silício com álcool isopropílico (IPA) e seque com nitrogênio. Asse a 200 °C por 5 minutos para desidratação.
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Litografia macia
NOTA: O wafer, colado na placa de Petri, precisa ser silanizado para evitar a adesão do PDMS às características do SU8.- Inverta o wafer (tocado em uma placa de Petri de plástico) sobre uma placa de vidro Petri do mesmo tamanho contendo 0,4 mL de metiltrichlorosilano (MTCS) e exponha o wafer aos vapores por 4 minutos. Vire o wafer e coloque a tampa na placa de Petri.
- Misture 30 g de base de elastômero de silicone ao agente de cura em uma proporção de 10:1. Tire a tampa da placa de Petri e despeje o polidimetilsiloxano (PDMS) no wafer, em seguida, degas dentro de um dessecador.
- Uma vez que todas as bolhas se foram, coloque o wafer a 80 °C por 1,5 h para curar o PDMS.
- Retire cuidadosamente o PDMS, e ponche entradas e saídas para as portas de tecido e canais de mídia com um soco de biópsia de 1 mm e 1,5 mm, respectivamente.
- Limpe os canais PDMS com fita adesiva para remover a poeira. Em seguida, mergulhe as tampas (18 x 18 mm, no.1) em 70% de etanol por pelo menos 15 min. Então, seque com lenços umedecidos.
- Sujeito tanto as tampas quanto os canais PDMS (lado do recurso exposto) ao plasma (configuração em alta) por 1 minuto, em seguida, unam-se rapidamente e coloquem em um forno de 80 °C durante a noite para fixar a ligação.
NOTA: Durante a ligação, é essencial aplicar uma pressão leve nas bordas dos canais PDMS para garantir uma boa vedação entre o PDMS e o vidro, evitando o próprio canal para evitar o colapso do canal.
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Preparação do dispositivo
- Submergir os dispositivos PDMS ligados em água desionizada (DI H2O) e autoclave com o ciclo líquido. Em seguida, aspire o líquido dos dispositivos e autoclave novamente com o ciclo de gravidade. Em seguida, desidratar os dispositivos esterilizados durante a noite a 80 °C.
2. Cultura de células-tronco (duração aproximada: 1-2 meses)
- hiPSC cultura e manutenção
NOTA: Os hiPSCs precisam ser cultivados por três passagens consecutivas após o descongelamento in vitro antes da criopreservação ou diferenciação. hiPSCs são cultivados em meio E8 ou mTeSR1, dependendo da linha celular, nas placas revestidas de matriz da membrana do porão24.- Para revestir placas com matriz de membrana de porão de qualidade hESC, descongele uma alíquota do meio de matriz (volume dependente de lotes, geralmente de 200-300 μL; armazenado a -80 °C) adicionando-o a 25 mL de DMEM/F-12K no gelo. Dispense 1 mL desta suspensão em cada poço de uma placa de 6 poços. Deixe a placa na incubadora a 37 °C por pelo menos 1h.
- Após o descongelamento, modifique a mídia E8 para a cultura hiPSC adicionando 5 μM de Y-2763225 (E8+RI). Use esta mídia por 24 horas depois, depois, depois mude a mídia para E8 fresco.
NOTA: Para mudanças rotineiras na mídia, a mídia E8 não modificada é usada para a cultura hiPSC. Para manutenção regular, a mídia E8 deve ser alterada todos os dias, aproximadamente 24 horas após a mudança de mídia anterior. - As células de passagem no dia 3 ou dia 4, aspiram a mídia, depois lavam cada poço com 1 mL da solução tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS).
NOTA: Certifique-se de que as células estão cerca de 70% confluentes. Não deixe que cresçam além de 70% de confluência. - Aspire o DPBS, em seguida, adicione 1 mL de 0,5 mM EDTA a cada poço e incubar em temperatura ambiente por 6-7 min.
- Aspire cuidadosamente EDTA, adicione 1 mL de E8+RI em cada poço e exploda contra a superfície com uma pipeta de 1 mL (~5-10 vezes para coletar todas as células). Colete a suspensão celular em um tubo de microcentrifuge de 15 mL.
- Conte a suspensão e a passagem da célula desejada (ou seja, ~200 Mil por poço) em E8+RI.
- Mude a mídia para E8 (sem RI) 24 h depois. Não deixe as células com RI por mais de 24 h.
NOTA: O E8 não deve ser aquecido a 37 °C. Deixe-o sempre em temperatura ambiente para o aquecimento antes da cultura celular.
- Cardiomiócito (CM) de diferenciação direcionada
NOTA: É importante observar a existência de heterogeneidade entre diferentes linhas dos hiPSCs26,27, de modo que as seguintes etapas podem precisar ser otimizadas para cada linha celular. Siga os passos abaixo para diferenciação de CM.- Prepare RPMI + B27 - insulina adicionando 10 mL de B27 menos insulina e 5 mL de penicilina/estreptomicina (caneta/estreptomes) a 500 mL de RPMI 1640.
- Prepare RPMI + B27 + insulina adicionando 10 mL de B27 e 5 mL de caneta/estreptococo a 500 mL de RPMI 1640.
- Prepare rpmi menos glicose + B27 + insulina adicionando 10 mL de B27, 5 mL de caneta/estreptococos e 4 mM de lactato de sódio a 500 mL de RPMI 1640 sem glicose.
- Uma vez que os hiPSCs atinjam 85% de confluência, comece a diferenciar (Dia 0) substituindo o antigo meio por 4 mL do RPMI + B27 - meio de insulina contendo 10 μM CHIR99021 para cada poço de uma placa de 6 poços (ou seja, adicionar 25 μL de 10 mM CHIR99021 em 25 mL de RPMI + B27 - insulina e, em seguida, imediatamente adicionar 4 mL por poço).
NOTA: CHIR99021 é um inibidor GSK e leva à ativação do Wnt. A concentração ideal de CHIR99021 e a confluência inicial variam para cada linhacelular 28. Verifique sempre um gradiente de concentração de 6-12 μM CHIR99021 e uma série de densidades de semeadura antes do experimento real para determinar condições ideais para iniciar a diferenciação. - Exatamente 24 horas depois (Dia 1), aspire o meio e substitua por 5 mL de RPMI pré-armado + B27 - insulina para cada poço.
- Exatamente 72 h após chir99021 adição (Dia 3), recolher 2,5 mL do meio gasto de cada poço da placa de 6 poços, totalizando 15 mL do meio gasto em um tubo.
- Para isso, adicione 15 mL de RPMI fresco + B27 - meio de insulina. Adicione IWP2 a uma concentração de 5 μM ao tubo médio combinado (ou seja, 1 μL de IWP2 a 5 mM por 1 mL de médio combinado ou 30 μL de IWP2 em 30 mL total de mídia).
- Remova ~1,5 mL do meio restante por poço da placa de modo que 1 mL do meio permaneça. Gire a placa vigorosamente para garantir a remoção adequada dos detritos celulares. Em seguida, aspire o resto do médio antigo e adicione 5 mL do meio combinado contendo IWP2 por poço da placa.
NOTA: A adição de IWP2 às células leva à inibição de Wnt. - No dia 5, aspire o meio de cada poço e substitua-o por 5 mL de RPMI pré-armado + B27 - insulina.
- Maturação CM: Nos dias 7, dia 9 e dia 11, aspire o meio de cada poço e substitua-o por 5 mL de RPMI pré-armado + B27 + insulina. Espancamentos espontâneos devem ser observados nos dias de hoje.
- Purificação cm: Nos dias 13 e dia 16, comece a fome de glicose aspirando o meio de cada poço, lavando cada poço com 1 mL de 1x DPBS, e depois adicionando 5 mL de RPMI pré-armado menos glicose + B27 + insulina, suplementado com 4 mM de lactato de sódio.
- No dia 19, aspire o meio gasto e substitua-o por 5 mL de RPMI pré-armado + B27 + insulina para cada poço para permitir a recuperação celular após a purificação.
- No dia 21, replate células, seguindo o abaixo descrito protocolo de dissociação cm (passo 3.3). Aponte para a placa 1.5-2 x 106 células por poço em uma placa de 6 poços. Por exemplo, se for uma diferenciação altamente eficiente, geralmente expandir os 6 poços em 9 poços é bom.
- A partir do dia 21, aspire o meio de cada poço e substitua-o por 4 mL de RPMI + B27 + insulina a cada 2-3 dias.
NOTA: Os hiPSC-CMs estão prontos para uso experimental após o dia 23.
3. Criação de tecido cardíaco 3D dentro do dispositivo microfluido: (Duração aproximada: 2-3 h)
- cultura hCF
- Fibroblastos cardíacos ventriculares de cultura (hCFs; obtidos comercialmente de Lonza) em frascos T75 (a 250K células por frasco) em Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Mude a mídia a cada dois dias, e passagem quando em 70% confluente. Use os hCFs antes da passagem 10, pois eles podem começar a se diferenciar aos myofibroblasts nas passagens altas29.
- dissociação do hCF
- Para dissociar os hCFs, primeiro retire o frasco da incubadora. Coloque o frasco dentro do armário de biossegurança e comece a aspirar a mídia gasta do frasco. Em seguida, lave o frasco T75 com 3 mL de 1x DPBS. Feche a tampa e gire o frasco.
- Aspire o DPBS. Tome 3 mL de pré-armado 1x Trypsin-EDTA (0,05%) e adicioná-lo ao frasco. Incline o frasco e gire para cobrir a parte inferior. Deixe-o em uma incubadora de 37 °C por 4-6 min, verificando o frasco sob um microscópio para garantir que as células estejam se desprendendo, como evidenciado através da forma celular redonda e células flutuantes. Se não, então coloque o frasco de volta na incubadora por mais um minuto.
- Neutralize a ação de trypsin adicionando 3 mL de FGM3 pré-armado ao frasco. Em seguida, pipete a solução para cima e para baixo contra a parte inferior do frasco para desalojar os CFs.
- Colete a suspensão celular em um tubo de microcentrifuge de 15 mL. Pegue 10 μL da suspensão celular e dispense-a em um hemótmetro para contar as células com um microscópio.
- Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 4 min. Aspire o supernatante tomando cuidado para não perturbar a pelota celular.
- Resuspense a pelota em FGM3 fresco, para fazer uma desejada 75 x 106 células/mL. Ou uma porção (células de 250K por frasco T75) ou segue o protocolo abaixo para gerar tecido cardíaco 3D.
- Dissociação de CM
NOTA: Após a diferenciação e purificação, prepare os CMs para uso na injeção em dispositivos microfluidos.- Tire a placa de CMs da incubadora e aspire a mídia. Em seguida, lave os poços com 1 mL de 1x DPBS por poço de uma placa de 6 poços. Tome 6 mL de DPBS e pipeta 1 mL por poço.
- Aspire o DPBS tomando cuidado para não perturbar as células presas à placa. Pipeta 6 mL de solução de descolamento de células quentes (por exemplo, Expresso TrypLE) e adicionar 1 mL por poço. Incubar as células em uma incubadora de 37 °C por 10 minutos.
- Neutralizar a enzima com um volume igual de insulina RPMI + B27+ (ou seja, 1 mL por poço) e dissociar mecanicamente as células ao pipetar para cima e para baixo contra o vaso cultural com uma pipeta de 1 mL.
- Colete os CMs em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 300 x g por 3 min.
- Aspire o supernatante. Resuspend a pelota celular em 5 mL de RPMI + B27 + insulina. Pipete a solução para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL para garantir a mistura adequada. Pegue 10 μL da suspensão da célula e dispense-a em um hemócito para determinar o número total da célula.
- Centrifugar as células novamente a 300 x g por 3 min (para garantir a remoção completa do TrypLE) e aspirar o supernasce. Em seguida, adicione um volume apropriado de RPMI + B27 + insulina para alcançar 75 x 106 células/mL.
NOTA: Se a diferenciação/seleção cardíaca não resultar em cm% elevado (ou seja, >80%), como evidenciado através de imunostaining ou citometria de fluxo para proteínas específicas de CM como o TNT, não considere as células como adequadas para a formação tecidual. O processo de diferenciação deve ser otimizado quando isso acontece por meio do ajuste das concentrações CHIR99021 e densidade inicial de partida. Se a purificação de CM precisar de melhoria, outros métodos podem ser utilizados, como a classificação de CMs com classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou classificação celular ativada por magnético (MACS)30,31,32.
- Preparação de colágeno
NOTA: Prepare o colágeno a partir da alta concentração de caldo de colágeno (variando de 8-11 mg/mL). O colágeno usado para criar a mistura de célula:hidrogel está a 6 mg/mL, e a concentração final é de 2 mg/mL. Dependendo do número de dispositivos para injetar, o volume de solução de colágeno a ser feito precisa ser calculado de volta.- Mantenha todos os reagentes necessários no gelo dentro de um capuz de biossegurança.
NOTA: O colágeno é um hidrogel termoresponsivo. Portanto, a temperatura precisa permanecer baixa para evitar a polimerização prematura. - Pegue 75 μL de colágeno de estoque (8 mg/mL) e dispense-o em um tubo de microcentrifuuge no gelo. A solução de colágeno é muito viscosa, então lentamente aspira-a com uma pipeta.
- Tome 13,85 μL de mídia (ou seja, RPMI + B27 + insulina) e dispense-a no mesmo tubo.
- Em seguida, tome 10 μL de fenol vermelho e adicione à mistura e resuspend.
- Por último, pegue 1,15 μL de 1N NaOH e adicione à suspensão.
- Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, resuspenque a suspensão.
NOTA: O colágeno de estoque tem um pH ácido, exigindo a adição de NaOH para neutralizar antes de usá-lo para encapsular as células cardíacas. O vermelho fenol age como um indicador de pH; portanto, adicione isso antes da adição naOH. Neste ponto, a solução de colágeno será amarela, denotando sua acidez. Após a adição de NaOH, a solução deve ficar laranja para rosa claro, indicando sua neutralização.
- Mantenha todos os reagentes necessários no gelo dentro de um capuz de biossegurança.
- Mistura de hidrogel e preparação celular
NOTA: Nesta etapa, é feito o encapsulamento das células dentro do hidrogel à base de colágeno. As células, bem como todos os precursores do hidrogel, devem ser colocadas no gelo durante os próximos passos.- Neste ponto, se os CFs ainda não foram experimentados, armazene a suspensão cm em um tubo de centrífuga de 15 mL, com a tampa desparafusada para permitir o fluxo de gás, dentro de uma incubadora de 37 °C. Em paralelo, dissociar os CFs e coletar a uma densidade de 75 x 106 células/mL para carregamento do dispositivo.
- Misture os CMs suspensos com CFs a uma proporção de 4:1. Pegue uma alíquota de 8 μL de CMs e adicione a um tubo de centrífuga fresco no gelo. Em seguida, pegue 2 μL de CFs e adicione à suspensão celular no tubo centrífuga.
- Resuspend a suspensão celular, pegue 5,6 μL da suspensão celular, e coloque-a em um tubo de microcentrifuge fresco.
- Pegue 4 μL do colágeno apenas preparado nas etapas acima e adicione a uma mistura de 4:1 CM:CF. Adicione 2,4 μL de matriz de membrana de porão do fator de crescimento reduzida (GFR), tornando a densidade celular final como 35 x 106 células/mL para a injeção do dispositivo. Pipeta a mistura para cima e para baixo para garantir que a suspensão da célula seja homogênea.
- Inserção do dispositivo
NOTA: Uma vez que a mistura de hidrogel celular esteja preparada, ela precisa ser inserida nos dispositivos.- Retire os dispositivos microfluidos autoclavados do forno de 80 °C e coloque-os no Gabinete de Biossegurança por pelo menos 1 h antes da inserção da suspensão da célula para permitir que os dispositivos esfriem à temperatura ambiente, mantendo a esterilidade.
- Coloque os dispositivos em placas de Petri de 60 x 15 mm, a 3-4 dispositivos por prato. Encha uma placa de Petri de 150 x 15 mm com uma fina camada DI H2O para segurar 3 das placas de Petri de 60 x 15 mm. Esta etapa cria um ambiente umidificado em torno dos dispositivos microfluidos.
- Use uma nova ponta e resuspenque a célula: mistura de hidrogel completamente, tubos da suspensão enquanto o tubo permanece no gelo.
- Insira a ponta na porta de injeção do dispositivo e injete lentamente e de forma constante 3 μL da célula: suspensão de hidrogel na entrada da região tecidual de um dispositivo microfluido usando uma ponta de pipeta de 20 μL. Uma vez que a porta esteja cheia, pare a injeção e remova a ponta. Repita para todos os dispositivos, ou a totalidade da suspensão do hidrogel preparado.
NOTA: O pequeno volume da célula: a suspensão do hidrogel aquece/esfria muito rapidamente, por isso é pertinente manter a suspensão no gelo pelo maior tempo possível. Ao inserir, pipete a solução fora do gelo e insira em dispositivos o mais rápido possível, pois o hidrogel pode começar a polimerizar na ponta da pipeta. É importante criar pequenos volumes da suspensão de célula:hidrogel de cada vez, por isso, se muitos dispositivos forem injetados, a suspensão de célula:hidrogel terá que ser feita fresca para cada conjunto de 4 dispositivos. - Vire os dispositivos dentro de suas placas de Petri com pinças e coloque-os dentro da grande placa de Petri com água. Incubar em uma incubadora de 37 °C por 9 min para polimerização de hidrogel.
- Tire os dispositivos da incubadora, gire os dispositivos e incubar a 37 °C por 9 min para completar a polimerização do hidrogel.
- Injete RPMI + B27 + insulina nos canais de mídia de flanqueamento (~20 μL por dispositivo). Coloque os dispositivos de volta na incubadora a 37 °C. Mude a mídia dentro dos canais de mídia com rpmi fresco + B27 + insulina todos os dias. Os dispositivos foram demonstrados para serem cultivados de 14 a 21 dias20.
NOTA: Devido ao pequeno volume de mídia por chip, para evitar a evaporação da mídia, é importante manter os dispositivos dentro de uma grande placa de Petri cheia de DI H2O, que serve como uma câmara umidificada. Além disso, pequenas gotículas de excesso RPMI + B27 + insulina podem ser pipetas na parte superior das entradas/tomadas do canal durante as mudanças de rotina da mídia.
4. Análise de tecidos
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Imagem ao vivo
NOTA: Todas as imagens ao vivo devem ser realizadas com uma incubadora de estágio para manter 37 °C e 5% de CO2.- Coloque dispositivos em uma incubadora de estágio ambientalmente controlada. Grave vídeos de 30 s de vários pontos dentro de cada dispositivo na taxa máxima de quadros.
- Para avaliar a contratude tecidual após a extração dos sinais de espancamento, use o código MATLAB escrito sob medida para extrair picos (Arquivo Suplementar 2) para calcular a variabilidade do intervalo entre batidas.
- Mude a mídia em dispositivos na capa da cultura celular, depois coloque de volta na incubadora de cultura celular.
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Manchas imunofluorescentes
- Prepare o PBS-Glycine: Dissolva 100 mM de glycina no PBS e adicione 0,02% naN3 para armazenamento a longo prazo. Ajuste o pH para 7,4.
- Prepare o PBS-Tween-20: Adicione 0,05% Tween-20 ao PBS e adicione 0,02% naN3 para armazenamento a longo prazo. Ajuste o pH para 7,4.
- Prepare o buffer IF: Adicione 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA e 0,05% Tween-20 ao PBS e adicione 0,02% NaN3 para armazenamento a longo prazo. Ajuste o pH para 7,4.
- Prepare 10% Soro de cabra: Resuspend o soro de cabra liofilizado em 2 mL de PBS para fazer 100% soro de cabra. Em seguida, diluir os 2 mL com 18 mL de PBS para fazer 10% de soro de cabra.
- Corrija as amostras adicionando 4% de paraformaldeído (PFA) aos canais teciduais e incubando a 37 °C por 20 min.
- Lave as células adicionando PBS-Glycine aos canais teciduais 2x para incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as células adicionando PBS -Tween-20 por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Permeabilize as células adicionando tampão IF aos canais teciduais por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Bloqueie as células adicionando 10% de solução de soro de cabra aos canais teciduais por 1h à temperatura ambiente.
- Diluir os anticorpos primários não conjugados em 10% de soro de cabra nas concentrações desejadas (consulte o Arquivo Suplementar 3),adicionar aos canais teciduais e incubar as amostras a 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, lave as amostras adicionando PBS-Tween-20 aos canais teciduais 3x por 20 minutos cada a temperatura ambiente.
NOTA: A partir do passo 4.2.12 em diante, execute todas as tarefas no escuro, para que as amostras sejam protegidas da luz. - Diluir os anticorpos secundários em PBS-Tween-20 nas concentrações desejadas, centrífugas a 10.000 x g por 10 minutos para coletar quaisquer precipitados e, em seguida, adicionar aos canais teciduais.
- Depois de 30 min-1 h, lave as amostras com PBS-Tween-20 3x por 10 min cada a temperatura ambiente.
- Adicione o meio de montagem anti-fade ou desejado aos canais teciduais. Em seguida, as amostras podem ser imagens usando microscopia de fluorescência ou com um microscópio confocal, se for desejada maior ampliação. Para visualizar todo o tecido 3D, imagens em diferentes z-planes podem ser empilhadas e reconstruídas para formar imagens 3D representativas.
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Representative Results
Para obter uma população altamente purificada de CMs de hiPSCs, uma versão modificada envolvendo uma combinação do protocolo de diferenciaçãolian 33 e as etapas de purificação de Tohyama34 é usada (consulte a Figura 1A para cronograma experimental). Os hiPSCs precisam ser parecidos com colônias, ~85% confluentes, e se espalhar uniformemente por toda a cultura bem 3-4 dias após a passagem, no início da diferenciação cm(Figura 1B). Especificamente, no dia 0, as colônias hiPSC devem ter uma alta expressão de fatores de transcrição de pluripotência, incluindo SOX2 e Nanog(Figura 1C). Com base neste protocolo, a evidência de um processo bem sucedido de diferenciação e purificação de células-tronco é demonstrada na Figura 1D,com colônias densas de CMs expressando sarcomeric α-actinin, com mínimos não-CMs circundantes. Além disso, os hCFs devem manter uma morfologia fibroblasto com alta expressão de vimentina(Figura 1E), de modo que eles devem ser usados antes de P10, pois podem começar a se diferenciar aos miofibroblasts em passagens mais altas29.
Para manter a natureza robusta deste protocolo, é pertinente implementar a replação dos hiPSC-CMs após a purificação metabólica. Devido à presença de células mortas e detritos que ocorrem devido à fome de glicose, os CMs precisam de um passo de purificação adicional para maximizar a pureza e a saúde do CM antes do uso no experimento; portanto, o replaping é usado, pois ajuda a soltar os detritos/ não-CMs mortos (Figuras 2A-B, Vídeos 1-2). O vídeo 1 mostra um exemplo populacional de CMs antes de replacar, apresentando uma alta pureza de CMs em múltiplas camadas, porém com muitos detritos presentes nas células e flutuando na mídia devido à purificação implementada. Correspondentemente, o Vídeo 2 mostra a mesma população de CMs imediatamente após a replação, apresentando os CMs em uma monocamada com detritos significativamente menores, demonstrando os efeitos da digestão tecidual e da dissociação unicelular que ocorrem durante a replação.
Após a inserção do hidrogel incorporado por células no dispositivo microfluido (ou seja, chip; imagem de entrada na Figura 3), as células são densas e espaçadas uniformemente em todos os postes. As células começam a se espalhar no dia 1(Figura 3A),então até o dia 7, elas retomam a batida e se tornam mais síncronas em seus padrões contratuais(Figura 3B). Além disso, os tecidos 3D se condensam ao redor dos postes para formar poros elípticos repetitivos, e as células alongam. Até o dia 14, os tecidos amadurecidos apresentam alto grau de anisotropia (ou seja, organização direcional), composta por células com forma alongada(Figuras 3C, 4A),sarcomeres estriados, alinhados e junções localizadas(Figura 4B). Além disso, os padrões contratuais espontâneos desses tecidos são altamente síncronas(Figura 4C, Vídeo 3) devido à natureza interconectada e alinhada das células cardíacas.
Figura 1: Imagens programáticas experimentais e representativas da morfologia celular durante a preparação para injeção do dispositivo: Esquema do protocolo, descrevendo etapas após a fabricação de dispositivos microfluidos, da cultura hiPSC à formação de tecido cardíaco microfluido(A). hiPSCs devem manter uma morfologia semelhante a uma colônia (B) e alta expressão de marcadores de pluripotência (SOX2, verde; Nanog, vermelho) (C) no início da diferenciação. Após a diferenciação hiPSC-CM, deve haver manchas abundantes e densas de CMs, manchadas com alfa-actinina sarcomeric (SAA, verde), com mínimos não-CMs circundantes, como evidenciado pela mancha de vimentina (vim, vermelho)(D). os HCFs devem apresentar altos níveis de expressão de vimentina e manter a morfologia do fibroblasto(E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: populações hiPSC-CM durante os últimos estágios de diferenciação: O processo de purificação causa a morte de não-CMs, produzindo detritos na cultura celular, presentes antes da replação de CM(A). Após a replação(B),os detritos e não-CMs são desalojados, servindo para purificar ainda mais a população de CM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Formação de tecido 3D cardíaco humano dentro do dispositivo microfluido: No dia seguinte à injeção no dispositivo (mostrado no inset superior esquerdo, ao lado da moeda americana para escala), as células começarão a se espalhar e serão densas e homogêneas distribuídas por todo o dispositivo(A). Após uma semana de cultura, as células retomarão a batida espontânea e formarão tecidos condensados e alinhados(B). Por duas semanas de cultura, as células formam tecidos condensados e alinhados ao redor dos postes elípticos(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Características representativas do tecido cardíaco humano após a cultura durante 14 dias no dispositivo microfluido: As células formaram tecidos alongados e altamente alinhados, como denotado pela coloração de actina(A). Os sarcomeres são paralelos e estriados, e há a localização de junções de lacunas como evidenciado através da coloração para sarcomeric α-actinin (SAA) e connexin 43 (CX43), respectivamente(B). A contração espontânea é síncronia(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Contração espontânea de hiPSC-CMs no dia 21 após a purificação do lactato e antes de replacar Clique aqui para baixar este Vídeo.
Vídeo 2: Contração espontânea de hiPSC-CMs no dia 23 após replacar Clique aqui para baixar este Vídeo.
Vídeo 3: Contração síncroca e espontânea do tecido cardíaco humano dentro do dispositivo por 14 dias Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo complementar 1: Arquivo AutoCAD para dispositivo coração em um chip Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 2: Programa MATLAB para extrair picos para determinar a variabilidade do intervalo entre batidas de sinais de batida Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo complementar 3: Tabela de anticorpos primários e secundários Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A formação de um modelo de tecido cardíaco humano in vitro com interações células-células aprimoradas e estrutura 3D biomimética é imprescindível para pesquisas cardiovasculares básicas e aplicações clínicas correspondentes1. Este protocolo delineado explica o desenvolvimento de tecido cardíaco anisotrótrópico humano 3D dentro de um dispositivo microfluido, utilizando co-cultura de CMs derivados de células-tronco com CFs conectivos encapsulados dentro de um hidrogel de colágeno, servindo para modelar a complexa composição celular e estrutura do miocárdio nativo. Este protocolo específico é altamente reprodutível, pois a estrutura particular do dispositivo foi otimizada e validada para formação de tecido cardíaco anisotrótrópico 3D de ambas as células cardíacas derivadas de ratos, e CMs de células-tronco humanas diferenciadas, de hESCs, e dois tipos de hiPSCs (SCVI20 e IMR90-4), como demonstrado em nossa recentepublicação 20. Nós, entre muitos outros grupos, descobrimos que a eficiência da diferenciação de CM das células-tronco varia entre as linhascelulares 35,36. O protocolo de purificação implementado auxilia no aumento do rendimento de diferenciação; no entanto, o tempo de purificação depende da linha celular e da eficiência de diferenciação. Portanto, o sucesso resultante na formação dos tecidos microfluidos pode variar entre as linhas celulares.
Para capturar componentes pertinentes do miocárdio, a composição celular para os tecidos demonstrados é principalmente uma mistura de CMs e CFs, pois os CMs comprometem a maior parte do volume, enquanto os CFs retêm a maior parte da população celular dentro do coração37. Além disso, a razão particular de 4:1 CM:CFs foi amplamente validada em trabalhos publicados recentemente20 para resultar em estrutura ideal e formação de tecido cardíaco dentro desta plataforma. Estudos futuros envolvendo esta plataforma descrita poderiam ser ainda mais avançados em sua complexidade por suplementação com outros tipos de células penitentes para melhor imitar o miocárdio nativo. Por exemplo, descobriu-se recentemente que os macrófagos residentes são integrantes em processos de condução dentro do coração38, além de seu papel bem documentado na resposta imune39. Portanto, os macrófagos poderiam ser incorporados na mistura celular antes do encapsulamento de hidrogel para modelar macrófagos cardíacos residentes. Alternativamente, os monócitos poderiam ser entregues através dos canais de mídia como um modelo de recrutamento através da circulação sanguínea, o que pode levar a uma população de macrófagos inflamatórios dentro do tecido cardíaco.
Existem vantagens inerentes ao uso de um dispositivo microfluido como plataforma para construir modelos de tecido 3D. Particularmente, experimentos precisos baseados em difusão podem ser estabelecidos através do controle exato de produtos químicos, moléculas ou gases que permitem gradientes de concentração em um dispositivo18,20. Além disso, diversos conjuntos de tipos de células40 e fluxo de fluidos podem ser incorporados para imitar condições dinâmicas de cultura e proporcionar estresse de cisalhamento em células semeadas41. Este último pode ser de uso particular no estudo de um sistema vascular incorporado dentro do chip, uma vez que as células endoteliais podem ser semeadas nos canais de mídia adjacentes (como já demonstramos usando este dispositivo para modelar astrócitos-em-um-chip23), e o fluxo constante de fluidos para imitar capilares pode ser facilmente incorporado através de uma bomba baseada no vácuo ou baseada na gravidade.
Outro benefício do dispositivo microfluido é o material (ou seja, PDMS) usado para fabricar os canais do dispositivo. Especificamente, o PDMS é um polímero transparente, barato e biocompatível42 com rigidez facilmente ajustável. O passo limitante na fabricação desses dispositivos está na fotolitografia, pois a técnica requer acesso a uma sala de limpeza e aquisição da habilidade associada. No entanto, uma vez que o wafer é fabricado, ele pode ser usado para fazer centenas de dispositivos através do processo de litografia suave direto para criar os canais PDMS e o simples ato de ligação plasmática para selar os canais a deslizamentos de cobertura. Em estudos futuros, se o dispositivo fosse modificado para incluir a capacidade de medir propriedades elétricas do tecido em tempo real, uma etapa adicional de montagem do dispositivo com eletrodos e componentes condutores teria que ser incorporada no processo de fabricação. O uso de PDMS para fabricar o canal pode reter limitações, particularmente se utilizado em construções para estudos de resposta a medicamentos, já que o PDMS foi encontrado para adsorb pequenas moléculas hidrofóbicas43,44,45. Assim, outros materiais, como termoplásticos46,47,poderiam ser investigados como alternativas ao PDMS durante o processo de litografia suave.
Um passo crítico neste protocolo delineado é a etapa 3.6.4 detalhando a inserção celular:hidrogel nos dispositivos microfluidos. Algumas variáveis-chave precisam ser controladas para garantir o sucesso, incluindo temperatura, tempo e manuseio adequado. Se as soluções de estoque de hidrogel ou a solução de células preparadas:hidrogel atingirem a temperatura ambiente, elas correm o risco de polimerização parcial, o que é irreversível, tornando a solução viscosa e quase impossível de injetar no dispositivo sem vazamento nos canais de mídia. Por outro lado, a solução de célula:hidrogel não pode congelar, pois as células morrerão; portanto, a solução deve ser mantida dentro desta janela de temperatura estreita. Da mesma forma, a quantidade de tempo decorrido entre a preparação do hidrogel celular e a injeção do dispositivo relaciona-se diretamente com o aumento da temperatura da solução preparada. Especificamente, assim que a solução é feita e a alíquota (ou seja, 3 μL) é obtida, a pipeta que segura a alíquota deve ser reposicionada, de modo que a ponta está dentro das portas do dispositivo, e a alíquota deve ser lentamente e constantemente inserida no dispositivo. Ao longo dessa transição, o pequeno volume está dentro de uma ponta de pipeta que está em temperatura ambiente, portanto, a solução está aumentando rapidamente a temperatura do gelo em que foi preparado (ou seja, -20 °C), exigindo um processo de injeção bastante rápido. Se a sensibilidade à temperatura do hidrogel à base de colágeno se tornar um fator-chave durante a injeção do dispositivo, a incorporação de outros hidrogéis48, como hidrogéis fotocrosslinkable (ou seja, GelMA)47,49,50,51 ou hidrogéis enzimáticamente transligados (i.e., fibrina)11,52,53, poderiam ser explorados.
O desenho do dispositivo microfluido incluído neste protocolo permite o estabelecimento de um tecido anisotrótrópico devido à presença dos postes elípticos escalonados e salientes dentro do canal principal do tecido20. Esse recurso é vantajoso em relação a outros métodos, como a impressão de contato do ECM, pois não requer uma etapa de manuseio para criar a topografia que pode levar à variação entre as amostras devido à deformação do selo ou à difusão de tinta54. No entanto, como dito anteriormente, muitas vezes há dificuldades inerentes à injeção de uma célula: suspensão de hidrogel em um canal de dispositivo, particularmente em um canal com postagens inatas. Para isso, a pressão de manuseio da inserção do dispositivo é bastante sensível. O processo de injeção deve ser constante, a uma pressão consistente e relativamente baixa para evitar qualquer vazamento nos canais de mídia.
Além disso, as bolhas não podem ser introduzidas durante a preparação da solução ou durante a inserção do dispositivo, pois as bolhas causarão vazamento do canal principal do tecido para os canais de mídia. Assim, é necessário cuidado adequado para controlar o manuseio, temperatura e tempo da injeção de hidrogel celular para garantir o sucesso na formação de tecido distribuído 3D de forma homogênea. Portanto, a prática no manuseio dos dispositivos microfluidos antes dos experimentos de cultura celular pode ser benéfica. A manutenção posterior dos tecidos dentro de dispositivos microfluidos é bastante simples, simplesmente necessitando de uma mudança diária de mídia de 20 μL de volume, e a base de deslizamento de tampas do dispositivo torna o manuseio conveniente durante a imagem em tempo real.
Em resumo, o protocolo aqui descrito utiliza uma combinação de técnicas de micromoldagem, incluindo fotolitografia e litografia macia, para criar uma arquitetura intrincada dentro de um dispositivo microfluido que induz altos níveis de anisotropia tecidual 3D, com técnicas biológicas robustas, incluindo diferenciação de células-tronco, cultura celular humana primária e biomateriais à base de hidrogel. O resultado final do protocolo delineado é um tecido cardíaco alinhado, co-cultivado em 3D dentro de um chip microfluido com um fenótipo maduro, que tem sido validado repetidamente para vários tipos e linhas de células diferentes20,tornando-o adequado para modelagem de doenças e aplicações pré-a jusante.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Award (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) e ao Prêmio Flinn Foundation por fornecer fontes de financiamento para este projeto. A linha hiPSC, SCVI20, foi obtida de Joseph C. Wu, MD, PhD no Stanford Cardiovascular Institute financiado pelo NIH R24 HL117756. A linha hiPSC, IMR90-4, foi obtida pelo WiCell Research Institute55,56.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
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