Целью этого протокола является объяснение и демонстрация разработки трехмерной (3D) микрофлюидной модели высокоровневой сердечной ткани человека, состоящей из кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, совместно культивируемых с сердечными фибробластами (FF) в биомиметическом гидрогеле на основе коллагена, для применения в инженерии сердечной ткани, скрининге лекарств и моделировании заболеваний.
Основной причиной смерти во всем мире по-прежнему является сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Тем не менее, моделирование физиологической и биологической сложности сердечной мышцы, миокарда, как известно, трудно выполнить in vitro. В основном, препятствия заключаются в потребности в кардиомиоцитах человека (КМ), которые либо являются взрослыми, либо демонстрируют взрослые фенотипы и могут успешно воспроизводить клеточную сложность миокарда и сложную 3D-архитектуру. К сожалению, из-за этических проблем и отсутствия доступной первичной сердечной ткани человека, полученной от пациента, в сочетании с минимальным распространением КМ, поиск жизнеспособных человеческих КМ был ограничивающим шагом для инженерии сердечной ткани. С этой целью большинство исследований перешли к сердечной дифференцировке индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в качестве основного источника ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ СМ, что привело к широкому включению hiPSC-CMs в анализы in vitro для моделирования сердечной ткани.
Здесь, в этой работе, мы демонстрируем протокол для разработки 3D-зрелой сердечной ткани человека, полученной из стволовых клеток, в микрофлюидном устройстве. Мы специально объясняем и визуально демонстрируем производство 3D-модели анизотропной сердечной ткани in vitro на чипе из КМ, полученных из hiPSC. Мы в первую очередь описываем протокол очистки для выбора для КМ, ко-культуру клеток с определенным соотношением путем смешивания КМ с человеческими ХФ (hCF) и суспензию этой кокультуры в гидрогеле на основе коллагена. Далее мы демонстрируем инъекцию нагруженного клетками гидрогеля в наше четко определенное микрофлюидное устройство, встроенное в шахматном порядке эллиптические микропосты, которые служат топографией поверхности, чтобы вызвать высокую степень выравнивания окружающих клеток и гидрогелевой матрицы, имитируя архитектуру нативного миокарда. Мы предполагаем, что предлагаемая 3D-анисотропная модель сердечной ткани на чипе подходит для фундаментальных биологических исследований, моделирования заболеваний и, благодаря ее использованию в качестве инструмента скрининга, фармацевтического тестирования.
В последние годы широко изучены подходы к тканевой инженерии для сопровождения клинических результатов in vivo в регенеративной медицине и моделировании заболеваний1,2. Значительное внимание было уделено моделированию сердечной ткани in vitro из-за присущих трудностей в поиске первичной сердечной ткани человека и производстве физиологически значимых суррогатов in vitro, ограничивая фундаментальное понимание сложных механизмов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)1,3. Традиционные модели часто включали 2D-анализы монослойной культуры. Тем не менее, важность культивирования сердечных клеток в 3D-среде для имитации как нативного ландшафта миокарда, так и сложных клеточных взаимодействий была широко охарактеризована4,5. Кроме того, большинство моделей, произведенных до сих пор, включали монокультуру КМ, дифференцированных от стволовых клеток. Тем не менее, сердце состоит из нескольких типов клеток6 в сложной 3D-архитектуре7,что оправдывает критическую необходимость улучшения сложности состава тканей в рамках 3D-моделей in vitro для лучшей имитации клеточных компонентов нативного миокарда.
На сегодняшний день было изучено много различных подходов к созданию биомиметических 3D-моделей миокарда8. Эти подходы варьируются от экспериментальных установок, которые позволяют в режиме реального времени рассчитывать генерируемую силу, от монокультурных КМ, посеянных на тонких пленках (считающихся мышечными тонкими пленками (MTF))9,до совместной культивирования сердечных клеток в 3D-гидрогелевых матрицах, взвешенных среди отдельно стоящих кантилеверов (считающихся инженерными тканями сердца (ET))10. Другие подходы были сосредоточены на реализации методов микроформования для имитации анизотропии миокарда, от монокультурных КМ в 3D-гидрогеле, суспендированном среди выступающих микропостов в тканевомпятне 11,до монокультурных КМ, посеянных среди вдавленных микроплодов12,13. Каждому из этих методов присущи ими преимущества и недостатки, поэтому уместно использовать технику, которая согласуется с предполагаемым применением и соответствующим биологическим вопросом.
Способность усиливать созревание КМ, полученных из стволовых клеток, имеет важное значение для успешной инженерии in vitro взрослой ткани миокарда и трансляции последующих результатов в клинические интерпретации. С этой целью методы зрелых КМ были широко исследованы, как в 2D, так и в 3D14,15,16. Например, электрическая стимуляция, включенная в ЭХТ, принудительное выравнивание КМ с топографией поверхности, сигнальными сигналами, факторами роста от кокультуры и / или условиями 3D-гидрогеля и т. Д., Все это приводит к изменению в пользу созревания СМ по меньшей мере в одном из следующих: морфология клеток, обработка кальция, саркомерная структура, экспрессия генов или сократительная сила.
Из этих моделей подходы, использующие микрофлюидные платформы, сохраняют определенные преимущества в природе, такие как контроль градиентов, ограниченный ввод клеток и минимальные необходимые реагенты. Кроме того, многие биологические реплики могут быть сгенерированы одновременно с использованием микрофлюидных платформ, служащих для лучшего препарирования интересующего биологического механизма и увеличения размера экспериментальной выборки в пользу статистической мощности17,18,19. Кроме того, использование фотолитографии в процессе изготовления микрофлюидных устройств позволяет создавать точные признаки (например, топографии) на микро- и наноуровне, которые служат мезоскопическими сигналами для улучшения окружающей клеточной структуры и архитектуры тканей на макроуровне18,20,21, 22 для различных применений в регенерации тканей и моделировании заболеваний.
Ранее мы продемонстрировали разработку новой 3D-модели сердечной ткани на чипе, которая включает топографию поверхности в виде врожденных эллиптических микропостов для выравнивания гидрогелево-инкапсулированных кокумулированных сердечных клеток во взаимосвязанную анисотропную ткань20. После 14 дней культивирования ткани, образующиеся в микрофлюидном устройстве, являются более зрелыми по своему фенотипу, профилю экспрессии генов, характеристикам обработки кальция и фармацевтическому ответу по сравнению с монослойным и 3D-изотропным контролем23. Протокол, описанный в настоящем описании, описывает способ создания этой 3D-совместно культивируемой, выровненной (т.е. анизотропной) сердечной ткани человека в микрофлюидном устройстве с использованием ХМ, полученных из hiPSC. В частности, мы объясняем способы дифференцировки и очистки hiPSC в сторону КМ, добавление hCF с КМ для получения установленной популяции кокультур, введение клеточной популяции, инкапсулированной в гидрогеле коллагена, в микрофлюидные устройства, и последующий анализ 3D-сконструированных тканей с помощью сократительных и иммунофлуоресцентных анализов. Полученные 3D-инженерные микроткани подходят для различных применений, включая фундаментальные биологические исследования, моделирование сердечно-сосудистых заболеваний и фармацевтические испытания.
Формирование модели сердечной ткани человека in vitro с усиленными клеточными взаимодействиями и биомиметической 3D-структурой является обязательным для фундаментальных сердечно-сосудистых исследований и соответствующих клинических применений1. Этот описанный проток…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC), New Investigator Award (ADHS18-198872) и Flinn Foundation Award за предоставление источников финансирования для этого проекта. Линия hiPSC, SCVI20, была получена от Джозефа С. Ву, доктора медицинских наук, доктора философии в Стэнфордском сердечно-сосудистом институте, финансируемом NIH R24 HL117756. Линия hiPSC, IMR90-4, была получена из WiCell Research Institute55,56.
0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
EDTA | VWR | 45001-122 | |
Ethanol | |||
FGM3 | VWR | 10172-048 | |
GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
Glycine | Sigma | G8898-500G | |
Goat serum | VWR | 10152-212 | |
hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
IPA | |||
IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
MTCS | Sigma | 440299-1L | |
NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
EVG620 Aligner | EVG | ||
Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
Leica SP8 Confocal microscope | Leica |