Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF’ ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.
Dünya çapında önde gelen ölüm nedeni kardiyovasküler hastalık (CVD) olarak devam etmektedir. Bununla birlikte, kalp kasının fizyolojik ve biyolojik karmaşıklığını modellemek, miyokard, in vitro yapmak oldukça zordur. Esas olarak, engeller, yetişkin olan veya yetişkin benzeri fenotipler sergileyen ve miyokard’ın hücresel karmaşıklığını ve karmaşık 3D mimarisini başarıyla çoğaltabilen insan kardiyomiyositlerine (CD) ihtiyaç duymaktadır. Ne yazık ki, etik kaygılar ve mevcut birincil hasta kaynaklı insan kardiyak dokusunun eksikliği nedeniyle, CD’lerin minimum çoğalması ile birlikte, uygulanabilir insan CD’lerinin tedariki kardiyak doku mühendisliği için sınırlayıcı bir adım olmuştur. Bu amaçla, çoğu araştırma insan INDÜKLENEN pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ ler) kardiyak farklılaşmasına doğru insan CD’lerinin birincil kaynağı olarak geçiş yapmış ve bu da hiPSC-CM’lerin kardiyak doku modellemesi için in vitro tahliller içinde geniş bir şekilde birleştirilmesiyle sonuçlanmıştır.
Burada, bu çalışmada, mikroakışkan bir cihaz içinde 3D olgun kök hücre türevi insan kardiyak dokusu geliştirmek için bir protokol gösteriyoruz. HiPSC türevli CD’lerden çip üzerinde 3D in vitro anizotropik kardiyak doku modelinin üretimini özellikle açıklıyor ve görsel olarak gösteriyoruz. Öncelikle CD’ler için seçilecek bir arınma protokolü, CD’lerin insan CF’leri (hCF’ ler) ile karıştırılması yoluyla tanımlanmış bir orana sahip hücrelerin ortak kültürü ve kollajen bazlı hidrojel içinde bu ortak kültürün askıya alınması. Hücre yüklü hidrojelin, çevredeki hücrelerin ve hidrojel matrisinin yüksek derecede hizalanmasına neden olmak için yüzey topografyası görevi gören kademeli eliptik mikro direklerle gömülü, iyi tanımlanmış mikroakışkan cihazımız içine enjeksiyonunu da gösteriyoruz, yerel miyokard mimarisini taklit ediyoruz. Önerilen 3D anizotropik kardiyak doku çip üzerinde modelin temel biyoloji çalışmaları, hastalık modellemesi ve tarama aracı olarak kullanılması yoluyla farmasötik testler için uygun olduğunu öngörüyoruz.
Doku mühendisliği yaklaşımları, son yıllarda rejeneratif tıp ve hastalık modellemesinde in vivo klinik bulgulara eşlik etmek için yaygın olarak araştırılmaktadır1,2. Özellikle in vitro kardiyak doku modellemesine, insan primer kardiyak dokusunun tedarik edilmesi ve fizyolojik olarak ilgili in vitro taşıyıcıların üretilmesindeki doğal zorluklar nedeniyle önemli öneme sahiptir, kardiyovasküler hastalıkların karmaşık mekanizmalarının temel anlayışını sınırlamıştır (CVD’ler)1,3. Geleneksel modeller genellikle 2D monolayer kültür tahlillerini içermektedir. Bununla birlikte, miyokard hem de karmaşık hücresel etkileşimlerin hem doğal manzarasını taklit etmek için 3D bir ortamda kardiyak hücrelerin kült haline getirildiğinin önemi kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir4,5. Ek olarak, şimdiye kadar üretilen çoğu model, kök hücrelerden farklılaştırılmış bir CD mono-kültürünü içermektedir. Bununla birlikte, kalp karmaşık bir 3D mimari7içinde birden fazla hücre tipi6 ‘dan oluşur , yerel miyokardın hücresel bileşenlerini daha iyi taklit etmek için 3D in vitro modellerde doku bileşiminin karmaşıklığını artırmak için kritik ihtiyacı garanti eder.
Bugüne kadar, miyokard8’inbiyomimetik 3D modellerini üretmek için birçok farklı yaklaşım araştırıldı. Bu yaklaşımlar, üretilen kuvvetin gerçek zamanlı olarak hesaplanmasına izin veren deneysel kurulumlardan, ince filmlerde tohumlanan mono-kültürCD’lerinden(kas ince filmler (MTF’ler) 9 ,serbest duran kantileterler arasında askıya alınan 3D hidrojel matrislerdeki ortak kültür kardiyak hücrelere (mühendislik kalp dokuları (EHT’ler)10. Diğer yaklaşımlar, bir doku yamasında çıkıntılı mikro direkler arasında asılı olan 3D hidrojeldeki mono-kültür CD’lerinden girintili mikrogroovlar arasında tohumlanan mono-kültürCD’lerinekadar miyokardsal anizotropiyi taklit etmek için mikromolding tekniklerinin uygulanmasına odaklanmıştır12,13. Bu yöntemlerin her birinin doğal avantajları ve dezavantajları vardır, bu nedenle, amaçlanan uygulama ve ilgili biyolojik soru ile uyumlu tekniği kullanmak önemlidir.
Kök hücre türevi CD’lerin olgunlaşmasını artırma yeteneği, yetişkin benzeri miyokard dokusunun başarılı in vitro mühendisliği ve sonraki bulguların klinik yorumlara çevrilebilmesi için gereklidir. Bu amaçla, CD’leri olgunlaştıran yöntemler hem 2D hem de 3D14 , 15,16. Örneğin, EHT’lere dahil edilen elektriksel stimülasyon, CD’lerin yüzey topografyası ile zorla hizalanması, sinyal ipuçları, ortak kültürden büyüme faktörleri ve/veya 3D hidrojel koşulları vb.
Bu modellerden, mikroakışkan platformları kullanan yaklaşımlar, gradyanların kontrolü, sınırlı hücre girişi ve minimum gerekli reaktifler gibi doğada belirli avantajları korur. Ayrıca, birçok biyolojik çoğaltma mikroakışkan platformlar kullanılarak aynı anda üretilebilir, bu da biyolojik ilgi mekanizmasını daha iyi parçalamaya ve deneysel örnek boyutunu istatistiksel güç lehine artırmaya hizmet eder17,18,19. Ek olarak, mikroakışkan cihaz imalat sürecinde fotolitikografinin kullanılması, doku yenilenmesi ve hastalık modellemesinde farklı uygulamalar için 18 ,20 , 21,22 hücresel yapısını ve makro düzeyde doku mimarisini geliştirmek için mezoskopik ipuçları görevi gören mikro ve nano düzeyde hassas özelliklerin (örneğin topografyalar) oluşturulmasını sağlar.
Daha önce, hidrojel kapsüllenmiş birlikte kültürlü kardiyak hücreleri birbirine bağlı, anizotropik bir dokuya hizalamak için doğuştan eliptik mikropostlar şeklinde yüzey topografyasını içeren yeni bir 3D kardiyak doku çip üzerinde modelin gelişimini gösterdik20. 14 günlük kültürden sonra, mikroakışkan cihaz içinde oluşan dokular, monolayer ve 3D izotropik kontrollere kıyasla fenotiplerinde, gen ekspresyon profillerinde, kalsiyum işleme özelliklerinde ve farmasötik yanıtlarında daha olgundur23. Burada açıklanan protokol, hiPSC türevli CD’ler kullanarak mikroakışkan cihaz içinde bu 3D birlikte kültürlü, hizalanmış (yani anizotropik) insan kalp dokusunu oluşturma yöntemini özetlemektedir. Özellikle, hiPSC’leri CD’lere göre ayırt etme ve arındırma yöntemlerini, yerleşik bir ortak kültür popülasyonu üretmek için HBC’lerin CD’lerle takviyesini, kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş hücre popülasyonunun mikroakışkan cihazlara yerleştirilmesini ve daha sonra 3D inşa edilen dokuların kontrtil ve immünofluoresan tahliller yoluyla analizini açıklıyoruz. Elde edilen 3D mühendislik mikro dokuları, temel biyoloji çalışmaları, CVD modellemesi ve farmasötik testler de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygundur.
Gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri ve biyomimetik 3D yapıya sahip bir in vitro insan kardiyak doku modelinin oluşturulması temel kardiyovasküler araştırmalar ve buna karşılık gelen klinik uygulamalar için zorunludur1. Bu özetlenmiş protokol, bir kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş bağ CD’leri ile kök hücre türevi CD’lerin ortak kültürünü kullanarak, yerel miyokardın karmaşık hücre bileşimini ve yapısını modellemeye hizmet eden bir mikroakışkan cihaz…
The authors have nothing to disclose.
Bu proje için finansman kaynakları sağlayan NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ABRC) Yeni Araştırmacı Ödülü’ne (ADHS18-198872) ve Flinn Vakfı Ödülü’ne teşekkür ederiz. SCVI20 hiPSC hattı, NIH R24 HL117756 tarafından finanse edilen Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü’nde doktoralı Joseph C. Wu’dan alınmıştır. HiPSC hattı, IMR90-4, WiCell Araştırma Enstitüsü55,56‘dan elde edildi.
0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
EDTA | VWR | 45001-122 | |
Ethanol | |||
FGM3 | VWR | 10172-048 | |
GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
Glycine | Sigma | G8898-500G | |
Goat serum | VWR | 10152-212 | |
hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
IPA | |||
IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
MTCS | Sigma | 440299-1L | |
NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
EVG620 Aligner | EVG | ||
Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
Leica SP8 Confocal microscope | Leica |