JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Published: June 15, 2021
doi:
10.3791/62539
,
1School of Biological and Health Systems Engineering,Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics,Arizona State University

Summary

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF’ ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Abstract

Dünya çapında önde gelen ölüm nedeni kardiyovasküler hastalık (CVD) olarak devam etmektedir. Bununla birlikte, kalp kasının fizyolojik ve biyolojik karmaşıklığını modellemek, miyokard, in vitro yapmak oldukça zordur. Esas olarak, engeller, yetişkin olan veya yetişkin benzeri fenotipler sergileyen ve miyokard’ın hücresel karmaşıklığını ve karmaşık 3D mimarisini başarıyla çoğaltabilen insan kardiyomiyositlerine (CD) ihtiyaç duymaktadır. Ne yazık ki, etik kaygılar ve mevcut birincil hasta kaynaklı insan kardiyak dokusunun eksikliği nedeniyle, CD’lerin minimum çoğalması ile birlikte, uygulanabilir insan CD’lerinin tedariki kardiyak doku mühendisliği için sınırlayıcı bir adım olmuştur. Bu amaçla, çoğu araştırma insan INDÜKLENEN pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ ler) kardiyak farklılaşmasına doğru insan CD’lerinin birincil kaynağı olarak geçiş yapmış ve bu da hiPSC-CM’lerin kardiyak doku modellemesi için in vitro tahliller içinde geniş bir şekilde birleştirilmesiyle sonuçlanmıştır.

Burada, bu çalışmada, mikroakışkan bir cihaz içinde 3D olgun kök hücre türevi insan kardiyak dokusu geliştirmek için bir protokol gösteriyoruz. HiPSC türevli CD’lerden çip üzerinde 3D in vitro anizotropik kardiyak doku modelinin üretimini özellikle açıklıyor ve görsel olarak gösteriyoruz. Öncelikle CD’ler için seçilecek bir arınma protokolü, CD’lerin insan CF’leri (hCF’ ler) ile karıştırılması yoluyla tanımlanmış bir orana sahip hücrelerin ortak kültürü ve kollajen bazlı hidrojel içinde bu ortak kültürün askıya alınması. Hücre yüklü hidrojelin, çevredeki hücrelerin ve hidrojel matrisinin yüksek derecede hizalanmasına neden olmak için yüzey topografyası görevi gören kademeli eliptik mikro direklerle gömülü, iyi tanımlanmış mikroakışkan cihazımız içine enjeksiyonunu da gösteriyoruz, yerel miyokard mimarisini taklit ediyoruz. Önerilen 3D anizotropik kardiyak doku çip üzerinde modelin temel biyoloji çalışmaları, hastalık modellemesi ve tarama aracı olarak kullanılması yoluyla farmasötik testler için uygun olduğunu öngörüyoruz.

Introduction

Doku mühendisliği yaklaşımları, son yıllarda rejeneratif tıp ve hastalık modellemesinde in vivo klinik bulgulara eşlik etmek için yaygın olarak araştırılmaktadır1,2. Özellikle in vitro kardiyak doku modellemesine, insan primer kardiyak dokusunun tedarik edilmesi ve fizyolojik olarak ilgili in vitro taşıyıcıların üretilmesindeki doğal zorluklar nedeniyle önemli öneme sahiptir, kardiyovasküler hastalıkların karmaşık mekanizmalarının temel anlayışını sınırlamıştır (CVD’ler)1,3. Geleneksel modeller genellikle 2D monolayer kültür tahlillerini içermektedir. Bununla birlikte, miyokard hem de karmaşık hücresel etkileşimlerin hem doğal manzarasını taklit etmek için 3D bir ortamda kardiyak hücrelerin kült haline getirildiğinin önemi kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir4,5. Ek olarak, şimdiye kadar üretilen çoğu model, kök hücrelerden farklılaştırılmış bir CD mono-kültürünü içermektedir. Bununla birlikte, kalp karmaşık bir 3D mimari7içinde birden fazla hücre tipi6 ‘dan oluşur , yerel miyokardın hücresel bileşenlerini daha iyi taklit etmek için 3D in vitro modellerde doku bileşiminin karmaşıklığını artırmak için kritik ihtiyacı garanti eder.

Bugüne kadar, miyokard8’inbiyomimetik 3D modellerini üretmek için birçok farklı yaklaşım araştırıldı. Bu yaklaşımlar, üretilen kuvvetin gerçek zamanlı olarak hesaplanmasına izin veren deneysel kurulumlardan, ince filmlerde tohumlanan mono-kültürCD’lerinden(kas ince filmler (MTF’ler) 9 ,serbest duran kantileterler arasında askıya alınan 3D hidrojel matrislerdeki ortak kültür kardiyak hücrelere (mühendislik kalp dokuları (EHT’ler)10. Diğer yaklaşımlar, bir doku yamasında çıkıntılı mikro direkler arasında asılı olan 3D hidrojeldeki mono-kültür CD’lerinden girintili mikrogroovlar arasında tohumlanan mono-kültürCD’lerinekadar miyokardsal anizotropiyi taklit etmek için mikromolding tekniklerinin uygulanmasına odaklanmıştır12,13. Bu yöntemlerin her birinin doğal avantajları ve dezavantajları vardır, bu nedenle, amaçlanan uygulama ve ilgili biyolojik soru ile uyumlu tekniği kullanmak önemlidir.

Kök hücre türevi CD’lerin olgunlaşmasını artırma yeteneği, yetişkin benzeri miyokard dokusunun başarılı in vitro mühendisliği ve sonraki bulguların klinik yorumlara çevrilebilmesi için gereklidir. Bu amaçla, CD’leri olgunlaştıran yöntemler hem 2D hem de 3D14 , 15,16. Örneğin, EHT’lere dahil edilen elektriksel stimülasyon, CD’lerin yüzey topografyası ile zorla hizalanması, sinyal ipuçları, ortak kültürden büyüme faktörleri ve/veya 3D hidrojel koşulları vb.

Bu modellerden, mikroakışkan platformları kullanan yaklaşımlar, gradyanların kontrolü, sınırlı hücre girişi ve minimum gerekli reaktifler gibi doğada belirli avantajları korur. Ayrıca, birçok biyolojik çoğaltma mikroakışkan platformlar kullanılarak aynı anda üretilebilir, bu da biyolojik ilgi mekanizmasını daha iyi parçalamaya ve deneysel örnek boyutunu istatistiksel güç lehine artırmaya hizmet eder17,18,19. Ek olarak, mikroakışkan cihaz imalat sürecinde fotolitikografinin kullanılması, doku yenilenmesi ve hastalık modellemesinde farklı uygulamalar için 18 ,20 , 21,22 hücresel yapısını ve makro düzeyde doku mimarisini geliştirmek için mezoskopik ipuçları görevi gören mikro ve nano düzeyde hassas özelliklerin (örneğin topografyalar) oluşturulmasını sağlar.

Daha önce, hidrojel kapsüllenmiş birlikte kültürlü kardiyak hücreleri birbirine bağlı, anizotropik bir dokuya hizalamak için doğuştan eliptik mikropostlar şeklinde yüzey topografyasını içeren yeni bir 3D kardiyak doku çip üzerinde modelin gelişimini gösterdik20. 14 günlük kültürden sonra, mikroakışkan cihaz içinde oluşan dokular, monolayer ve 3D izotropik kontrollere kıyasla fenotiplerinde, gen ekspresyon profillerinde, kalsiyum işleme özelliklerinde ve farmasötik yanıtlarında daha olgundur23. Burada açıklanan protokol, hiPSC türevli CD’ler kullanarak mikroakışkan cihaz içinde bu 3D birlikte kültürlü, hizalanmış (yani anizotropik) insan kalp dokusunu oluşturma yöntemini özetlemektedir. Özellikle, hiPSC’leri CD’lere göre ayırt etme ve arındırma yöntemlerini, yerleşik bir ortak kültür popülasyonu üretmek için HBC’lerin CD’lerle takviyesini, kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş hücre popülasyonunun mikroakışkan cihazlara yerleştirilmesini ve daha sonra 3D inşa edilen dokuların kontrtil ve immünofluoresan tahliller yoluyla analizini açıklıyoruz. Elde edilen 3D mühendislik mikro dokuları, temel biyoloji çalışmaları, CVD modellemesi ve farmasötik testler de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygundur.

Protocol

Biyogüvenlik Kabini içinde tüm hücre işleme ve reaktif hazırlamayı gerçekleştirin. Hücrelerle temas eden tüm yüzeylerin, malzemelerin ve ekipmanların steril olduğundan emin olun (yani% 70 etanol ile püskürtün). Hücreler nemlendirilmiş 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kültürlenmelidir. Tüm hiPSC kültürü ve farklılaşması 6 kuyulu plakalarda gerçekleştirilir. 1. Mikroakışkan cihaz oluşturma (yaklaşık süre: 1 hafta) Fotolithografi</stro…

Representative Results

HiPSC’lerden son derece saflaştırılmış bir CD popülasyonu elde etmek için, Lian farklılaşma protokolü33 ve Tohyama arıtma adımları34’ün bir kombinasyonunu içeren değiştirilmiş bir sürüm kullanılır (deneysel zaman çizelgesi için Şekil 1A’ya bakın). HiPSC’lerin koloni benzeri, ~% 85 birleştiği ve cm farklılaşmasının başlangıcında, geçişten 3-4 gün sonra kültür kuyusuna eşit olarak yayılması gerekir (<str…

Discussion

Gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri ve biyomimetik 3D yapıya sahip bir in vitro insan kardiyak doku modelinin oluşturulması temel kardiyovasküler araştırmalar ve buna karşılık gelen klinik uygulamalar için zorunludur1. Bu özetlenmiş protokol, bir kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş bağ CD’leri ile kök hücre türevi CD’lerin ortak kültürünü kullanarak, yerel miyokardın karmaşık hücre bileşimini ve yapısını modellemeye hizmet eden bir mikroakışkan cihaz…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje için finansman kaynakları sağlayan NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ABRC) Yeni Araştırmacı Ödülü’ne (ADHS18-198872) ve Flinn Vakfı Ödülü’ne teşekkür ederiz. SCVI20 hiPSC hattı, NIH R24 HL117756 tarafından finanse edilen Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü’nde doktoralı Joseph C. Wu’dan alınmıştır. HiPSC hattı, IMR90-4, WiCell Araştırma Enstitüsü55,56‘dan elde edildi.

Materials

0.65 mL centrifuge tubes VWR 87003-290
1 mm Biopsy punch VWR 95039-090
1.5 mm Biopsy punch VWR 95039-088
15 mL Falcon tubes VWR 89039-670
18x18mm coverslips VWR 16004-308 The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde ThermoFisher 101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates VWR 82050-844
B27 minus insulin LifeTech A1895602
B27 plus insulin LifeTech 17504001
CHIR99021 VWR 10188-030
Collagen I, rat tail Corning 47747-218
DMEM F12 ThermoFisher 11330057
DPBS ThermoFisher 21600069
E8 ThermoFisher A1517001 can also be made in house
EDTA VWR 45001-122
Ethanol
FGM3 VWR 10172-048
GFR-Matrigel VWR 47743-718
Glycine Sigma G8898-500G
Goat serum VWR 10152-212
hESC-Matrigel Corning BD354277
IPA
IWP2 Sigma I0536-5MG
Kimwipes VWR 82003-820
MTCS Sigma 440299-1L
NaN3 Sigma S2002-25G
NaOH Sigma S5881-500G
Pen/Strep VWR 15140122
Petri dish (150x15mm) VWR 25384-326
Petri dish (60x15mm) VWR 25384-092
Phenol Red Sigma P3532-5G
RPMI 1640 ThermoFisher MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose VWR 45001-110
Silicon Wafers (100mm) University Wafer 1196
Sodium lactate Sigma L4263-100ML
SU8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU8 Developer ThermoFisher NC9901158
Sylgard Elastomer Essex Brownell DC-184-1.1
T75 flasks VWR 82050-856
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
TrypLE ThermoFisher 12604021
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher 15400054
Tween20 Sigma P9416-50ML
Y-27632 Stem Cell Technologies 72304
EVG620 Aligner EVG
Plasma cleaner PDC-32G Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope Nikon
Leica SP8 Confocal microscope Leica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. . Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Recherche en cancérologie. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells – Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Tags

Microfluidic PlatformCardiovascular DiseaseMyocardiumStem Cell-derived CardiomyocytesCardiac FibroblastsCell DissociationCell CultureCell Alignment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Veldhuizen, J., Nikkhah, M. Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (172), e62539, doi:10.3791/62539 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image