マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発
Summary
このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。
Abstract
世界的に主要な死因は心血管疾患(CVD)として持続する。しかし、心筋の生理学的および生物学的複雑さをモデル化することは、心筋、 インビトロ で達成することは悪名高い困難である。主に、障害は、大人であるか、または成人のような型を示し、心筋の細胞複雑さと複雑な3Dアーキテクチャをうまく再現できる人間の心筋細胞(CM)の必要性にあります。残念ながら、倫理的な懸念と利用可能な一次患者由来のヒト心臓組織の欠如のために、CMの最小限の増殖と組み合わせることで、実行可能なヒトCMの調達は心臓組織工学の限界ステップであった。この目的のために、ほとんどの研究はヒトCMの主要な供給源としてヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の心臓分化に移行し、心臓組織モデリングのための インビトロ アッセイ内にhiPSC-CMを広く組み込むことになった。
本研究では、マイクロ流体装置内で3D成熟した幹細胞由来ヒト心臓組織を開発するためのプロトコルを示す。HiPSC由来のCMから3D インビトロ 異方性心臓組織オンチップモデルの生産を具体的に説明し、視覚的に実証する。我々は、主にCMに対して選択する精製プロトコル、ヒトCF(hCF)とCMを混合することによって定義された比率を有する細胞の共培養、およびコラーゲンベースのヒドロゲル内でのこの共培養の停止を記述する。我々はさらに、周囲の細胞とヒドロゲルマトリックスの高度な整列を誘導する表面地形として機能するずらした楕円マイクロポストを埋め込んだ、明確に定義されたマイクロ流体装置内の細胞を含むヒドロゲルの注入を実証し、天然心筋のアーキテクチャを模倣する。我々は、提案された3D異方性心臓組織オンチップモデルが基礎生物学研究、疾患モデリング、およびスクリーニングツールとしての使用を通じて、医薬品試験に適していると考える。
Introduction
組織工学的アプローチは広く探求されており、近年、再生医療および疾患モデリング1,2における生体内臨床所見に付随する。特に、ヒト原発性心臓組織を調達し、生理学的に関連する生体内サロゲートを産生する際の固有の困難のために、インビトロ心臓組織モデリングに重点が置かれていたので、心血管疾患(CVD)1,3の複雑なメカニズムの基本的な理解を制限する。従来のモデルは、しばしば2D単層培養アッセイを含む。しかし、心筋のネイティブな風景と複雑な細胞相互作用の両方を模倣するために3D環境内で心臓細胞を培養することの重要性は、4,5を大きく特徴づけられてきた。さらに、これまでに生産されたほとんどのモデルには、幹細胞から分化したCMの単一培養が含まれています。しかし、心臓は複雑な3Dアーキテクチャ7内の複数の細胞タイプ6で構成され、3D in vitroモデル内の組織組成の複雑さを改善し、ネイティブ心筋の細胞構成体をよりよく模倣する重要な必要性を保証する。
現在までに、多くの異なるアプローチが心筋8のバイオミメティック3Dモデルを生成するために探求されてきた。これらのアプローチは、生成された力のリアルタイム計算を可能にする実験的なセットアップから、薄膜に播種されたモノカルチャーCM(筋肉薄膜(MTFとみなされる)9)から、自立性カンチレバー(設計心臓組織(EHT))の間に浮遊する3Dヒドロゲルマトリックスの心臓細胞の共培養まで多岐にわたる。他のアプローチは、心筋異方性を模倣するマイクロモールディング技術の実施に焦点を当て、組織パッチ11内の突出マイクロポストの間に浮遊する3Dヒドロゲル中の単培養CMから、インデントマイクログルーブ12、13の間に播種された単一培養CMに。これらの方法のそれぞれに固有の長所と短所があり、したがって、意図された適用および対応する生物学的問題と一致する技術を利用することが適切である。
幹細胞由来のCMの成熟を高める能力は、成人様心筋組織の正常なインビトロ工学と、その後の知見を臨床解釈に翻訳するために不可欠である。このため、成熟したCMの方法は、2Dと3D14、15、16の両方で広く探求されてきました。例えば、EHTに組み込まれた電気刺激、表面地形によるCMの強制アライメント、シグナル伝達キュー、共培養からの成長因子、および/または3Dヒドロゲル条件などは、細胞形態、カルシウム処理、肉体構造、遺伝子発現、収縮力の少なくとも1つでCM成熟を支持する変化を招く。
これらのモデルのうち、マイクロ流体プラットフォームを利用するアプローチは、勾配の制御、限られた細胞入力、および最小限の必要な試薬など、本質的に一定の利点を保持します。さらに、多くの生物学的複製は、マイクロ流体プラットフォームを用いて一度に生成することができ、目的の生物学的機構をより良く解剖し、統計的パワー17、18、19を支持して実験サンプルサイズを増加させる役割を果たすことができる。さらに、マイクロ流体デバイスの製造プロセスでフォトリソグラフィーを使用すると、微細およびナノレベルでの正確な特徴(例えば、地形)を作成することができ、これは、組織再生および疾患モデリングにおける異なる用途に対して、周囲の細胞構造およびマクロレベル組織アーキテクチャ18、20、21、22を強化するメソスコピックキューとして機能するマイクロレベルおよびナノレベルでの正確な特徴を作成する。
我々は、先ず、表面地形を組み込んだ新規3D心臓組織オンチップモデルの開発を実証し、自然楕円形のマイクロポストの形態で、ヒドロゲルカプセル化された共培養心臓細胞を相互接続された異方性組織20に整列させた。培養の14日後、マイクロ流体デバイス内に形成された組織は、単層および3D等方性対照23と比較した場合に、その表現型、遺伝子発現プロファイル、カルシウム処理特性、および医薬応答においてより成熟している。本明細書に記載されているプロトコルは、この3D共培養を作成するための方法を概説し、 hiPSC由来のCMを用いたマイクロ流体装置内のヒト心臓組織(すなわち異方性)を具体的に説明する具体的には、HIPSCをCMに向けて区別および精製し、確立された共培養集団を産生するためにCMを用いてhCFを補充し、コラーゲンハイドロゲル内にカプセル化した細胞集団をマイクロ流体デバイスに挿入し、その後の3D組み立てられたtf結果として得られた3D工学的マイクロ組織は、基礎生物学研究、CVDモデリング、医薬品試験など、さまざまな用途に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞と細胞の相互作用が強化された生体外ヒト心臓組織モデルの形成とバイオミメティック3D構造は、基礎的な心血管研究および対応する臨床応用のために不可欠である。この概説されたプロトコルは、コラーゲンヒドロゲル内にカプセル化された結合性CFを有する幹細胞由来CMの共培養を用いて、天然心筋の複雑な細胞組成および構造をモデル化する役割を果たし、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
#1653193 NSF CAREERアワード、アリゾナ生物医学研究委員会(ABRC)新調査官賞(ADHS18-198872)、このプロジェクトの資金源を提供してくれたフリン財団賞に感謝します。hiPSCラインSCVI20は、NIH R24 HL117756が出資するスタンフォード心臓血管研究所のジョセフ・C・ウー博士(MD)から入手しました。HiPSCライン、IMR90-4は、WiCell研究所55、56から得られました。
Materials
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
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