Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

Summary

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Abstract

A principal causa de morte no mundo persiste como doença cardiovascular (DCV). No entanto, modelar a complexidade fisiológica e biológica do músculo cardíaco, o miocárdio, é notoriamente difícil de realizar in vitro. Principalmente, os obstáculos residem na necessidade de cardiomiócitos humanos (CMs) que são adultos ou exibem fenótipos adultos e podem replicar com sucesso a complexidade celular do miocárdio e a arquitetura 3D intrincada. Infelizmente, devido a preocupações éticas e falta de tecido cardíaco humano derivado do paciente primário disponível, combinado com a proliferação mínima de CMs, a fonte de CMs humanos viáveis tem sido um passo limitante para a engenharia de tecidos cardíacos. Para isso, a maioria das pesquisas passou para a diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) como a principal fonte de CMs humanos, resultando na ampla incorporação de hiPSC-CMs dentro de ensaios in vitro para modelagem de tecido cardíaco.

Aqui neste trabalho, demonstramos um protocolo para o desenvolvimento de um tecido cardíaco humano 3D derivado de células-tronco dentro de um dispositivo microfluido. Explicamos e demonstramos visualmente a produção de um modelo 3D in vitro de tecido cardíaco anisotrótrópico de CMs derivados de hiPSC. Descrevemos principalmente um protocolo de purificação para selecionar para CMs, a co-cultura das células com uma razão definida através da mistura de CMs com CFs humanos (hCFs), e suspensão desta co-cultura dentro do hidrogel à base de colágeno. Demonstramos ainda a injeção do hidrogel carregado de células dentro do nosso dispositivo microfluido bem definido, embutido com micropostos elípticos escalonados que servem como topografia superficial para induzir um alto grau de alinhamento das células circundantes e da matriz de hidrogel, imitando a arquitetura do miocárdio nativo. Prevemos que o modelo 3D anisotrópico de tecido cardíaco on-chip é adequado para estudos fundamentais de biologia, modelagem de doenças e, através de seu uso como ferramenta de triagem, testes farmacêuticos.

Introduction

Abordagens de engenharia de tecidos têm sido amplamente exploradas, nos últimos anos, para acompanhar os achados clínicos in vivo na medicina regenerativa e modelagem da doença^1,2. A ênfase significativa tem sido particularmente colocada na modelagem in vitro do tecido cardíaco devido às dificuldades inerentes à obtenção do tecido cardíaco primário humano e à produção fisiologicamente relevante substitutos in vitro, limitando a compreensão fundamental dos mecanismos complexos de doenças cardiovasculares (DCV)^1,3. Modelos tradicionais têm frequentemente envolvido ensaios de cultura monocamadas 2D. No entanto, a importância de aculturar células cardíacas dentro de um ambiente 3D para imitar tanto a paisagem nativa do miocárdio quanto as complexas interações celulares tem sido amplamente caracterizada^4,5. Além disso, a maioria dos modelos produzidos até agora incluiu uma monocultura de CMs diferenciadas das células-tronco. No entanto, o coração é composto por múltiplos tipos de células⁶ dentro de uma complexa arquitetura 3D^7,garantindo a necessidade crítica de melhorar a complexidade da composição tecidual dentro de modelos in vitro 3D para melhor imitar constituintes celulares do miocárdio nativo.

Até o momento, muitas abordagens diferentes foram exploradas para produzir modelos 3D biomiméticos do miocárdio⁸. Essas abordagens vão desde configurações experimentais que permitem o cálculo em tempo real da força gerada, desde CMs monoculturados em filmes finos (considerados filmes musculosos finos (MTFs))⁹, até células cardíacas de co-cultura em matrizes de hidrogel 3D suspensas entre cantilevers de pé livre (considerados tecidos cardíacos projetados (EHTs))¹⁰. Outras abordagens se concentraram na implementação de técnicas de micromoldagem para imitar a anisotropia miocárdia, desde CMs monocultura em um hidrogel 3D suspenso entre micropostos salientes em um patch de tecido¹¹, até CMs monocultura semeados entre microgrooves recuados^12,13. Há vantagens e desvantagens inerentes a cada um desses métodos, portanto, é pertinente utilizar a técnica que se alinha com a aplicação pretendida e a questão biológica correspondente.

A capacidade de melhorar a maturação de CMs derivados de células-tronco é essencial para a engenharia in vitro bem sucedida do tecido miocárdio adulto e tradução de achados subsequentes para interpretações clínicas. Para isso, os métodos para amadurecer CMs têm sido amplamente explorados, tanto em 2D quanto em^{3D 14,15,16}. Por exemplo, estimulação elétrica incorporada em EHTs, alinhamento forçado de CMs com topografia superficial, sinalização, fatores de crescimento da cocultura e/ou condições de hidrogel 3D, etc., tudo leva a uma mudança em favor da maturação de CM em pelo menos um dos seguintes: morfologia celular, manuseio de cálcio, estrutura sarvúrica, expressão genética ou força contratil.

Desses modelos, as abordagens que utilizam plataformas microfluídicas mantêm certas vantagens na natureza, como controle de gradientes, entrada celular limitada e reagentes mínimos necessários. Além disso, muitas réplicas biológicas podem ser geradas de uma só vez usando plataformas microfluídicas, servindo para dissecar melhor o mecanismo biológico de interesse e aumentar o tamanho amostral experimental em favor do poder estatístico^17,18,19. Além disso, o uso da fotolitografia no processo de fabricação de dispositivos microfluidos permite a criação de recursos precisos (por exemplo, topografias) no nível micro e nano, que servem como pistas mesoscópicas para melhorar a estrutura celular circundante e a arquitetura tecidual^18,20,21,22 para diferentes aplicações na regeneração tecidual e modelagem de doenças.

Anteriormente, demonstramos o desenvolvimento de um novo modelo de tecido cardíaco 3D no chip que incorpora topografia superficial, na forma de micropostos elípticos inatos, para alinhar células cardíacas co-cultivadas por hidrogel em um tecido anisotrópico interconectado²⁰. Após 14 dias de cultura, os tecidos formados dentro do dispositivo microfluido são mais maduros em seu fenótipo, perfil de expressão genética, características de manuseio de cálcio e resposta farmacêutica quando comparados com monocamadas e controles isotrópicos 3D²³. O protocolo aqui descrito descreve o método para a criação deste tecido cardíaco humano 3D co-cultivado, alinhado (ou seja, anisotrópico) dentro do dispositivo microfluido usando CMs derivados de hiPSC. Especificamente, explicamos os métodos para diferenciar e purificar hiPSCs em relação aos CMs, suplementação de HCFs com CMs para produzir uma população de cocultura estabelecida, inserção da população celular encapsulada dentro do hidrogel de colágeno nos dispositivos microfluidos e análise subsequente dos tecidos construídos em 3D através de ensaios contratuais e imunofluorescentes. Os microsaússeis projetados em 3D são adequados para várias aplicações, incluindo estudos fundamentais de biologia, modelagem de DCV e testes farmacêuticos.

Protocol

Realize toda a preparação de manuseio de células e reagentes dentro de um Gabinete de Biossegurança. Assegure-se de que todas as superfícies, materiais e equipamentos que entram em contato com as células são estéreis (ou seja, pulverizar com 70% de etanol). As células devem ser cultivadas em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% de CO2. Toda cultura e diferenciação hiPSC é realizada em placas de 6 poços. 1. Criação de dispositivo microfluido (duração aproximada: 1 …

Representative Results

Para obter uma população altamente purificada de CMs de hiPSCs, uma versão modificada envolvendo uma combinação do protocolo de diferenciaçãolian 33 e as etapas de purificação de Tohyama34 é usada (consulte a Figura 1A para cronograma experimental). Os hiPSCs precisam ser parecidos com colônias, ~85% confluentes, e se espalhar uniformemente por toda a cultura bem 3-4 dias após a passagem, no início da diferenciação cm<strong clas…

Discussion

A formação de um modelo de tecido cardíaco humano in vitro com interações células-células aprimoradas e estrutura 3D biomimética é imprescindível para pesquisas cardiovasculares básicas e aplicações clínicas correspondentes¹. Este protocolo delineado explica o desenvolvimento de tecido cardíaco anisotrótrópico humano 3D dentro de um dispositivo microfluido, utilizando co-cultura de CMs derivados de células-tronco com CFs conectivos encapsulados dentro de um hidrogel de c…

Materials

0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica