تطوير أنسجة القلب البشرية المنظمة ثلاثية الأبعاد ضمن منصة ميكروفلويديك
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو شرح وإظهار تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للفلوريد الدقيق لأنسجة القلب البشرية المنحازة للغاية ، والمكونة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي تشارك في استزراعها مع الخلايا الليفية القلبية (CFs) داخل هيدروجيل حيوي قائم على الكولاجين ، للتطبيقات في هندسة أنسجة القلب ، وفحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض.
Abstract
السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم لا يزال كما أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). ومع ذلك ، فإن نمذجة التعقيد الفسيولوجي والبيولوجي لعضلات القلب ، عضلة القلب ، من الصعب تحقيقها في المختبر. أساسا، تكمن العقبات في الحاجة إلى خلايا القلب البشرية (CMs) التي هي إما الكبار أو تظهر الأنماط الظاهرية مثل الكبار ويمكن تكرار بنجاح تعقيد عضلة القلب الخلوية والهندسة المعمارية المعقدة 3D. لسوء الحظ ، بسبب المخاوف الأخلاقية وعدم وجود أنسجة القلب البشرية الأولية المشتقة من المريض ، إلى جانب الحد الأدنى من انتشار CMs ، كان الحصول على CMs البشرية القابلة للحياة خطوة محدودة لهندسة أنسجة القلب. وتحقيقا لهذه الغاية، تحولت معظم البحوث نحو التمايز القلبي للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hiPSCs) كمصدر رئيسي ل CMs البشرية، مما أدى إلى دمج hiPSC-CMs على نطاق واسع ضمن المقايسات المختبرية لنمذجة الأنسجة القلبية.
هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير 3D ناضجة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic. نحن نشرح ونوضح بصريا إنتاج نموذج أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد في المختبر على رقاقة من CMs المشتقة من hiPSC. نحن نصف في المقام الأول بروتوكول تنقية لتحديد ل CMs، والثقافة المشتركة للخلايا مع نسبة محددة عن طريق خلط CMs مع CFs الإنسان (hCFs)، وتعليق هذه الثقافة المشتركة داخل الهيدروجيل القائم على الكولاجين. كما أننا نثبت حقن الهيدروجيل المحمل بالخلايا داخل جهازنا الدقيق الدقيق المحدد جيدا ، المضمن مع الأعمدة البيضاوية المتداخلة التي تعمل كتدبير سطحي للحث على درجة عالية من محاذاة الخلايا المحيطة ومصفوفة الهيدروجيل ، تحاكي بنية عضلة القلب الأصلية. ونحن نتصور أن النموذج المقترح 3D الأنسجة القلبية غير المثيلة على رقاقة مناسبة لدراسات البيولوجيا الأساسية, نمذجة الأمراض, ومن خلال استخدامه كأداة فحص, اختبار الأدوية.
Introduction
وقد تم استكشاف نهج هندسة الأنسجة على نطاق واسع، في السنوات الأخيرة، لمرافقة في النتائج السريرية في الجسم الحي في الطب التجديدي والنمذجة المرض1،2. وقد تم التركيز بشكل خاص على نمذجة الأنسجة القلبية في المختبر بسبب الصعوبات الكامنة في مصادر الأنسجة القلبية الأولية البشرية وإنتاج بدائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، مما يحد من الفهم الأساسي للآليات المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)1،3. وقد شملت النماذج التقليدية في كثير من الأحيان 2D مقايسات ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن أهمية زراعة خلايا القلب داخل بيئة ثلاثية الأبعاد لمحاكاة كل من المناظر الطبيعية الأصلية للقلب والتفاعلات الخلوية المعقدة قد تميزت على نطاق واسع4،5. بالإضافة إلى ذلك، شملت معظم النماذج المنتجة حتى الآن ثقافة أحادية من CMs تختلف عن الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يتكون القلب من أنواع خلايا متعددة6 داخل بنية ثلاثية الأبعاد معقدة7، مما يبرر الحاجة الماسة لتحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل نماذج المختبر ثلاثية الأبعاد لمحاكاة المكونات الخلوية للقلب العضلي الأصلي بشكل أفضل.
حتى الآن، تم استكشاف العديد من النهج المختلفة لإنتاج نماذج 3D المحاكاة الحيوية من عضلة القلب8. وتتراوح هذه النهج من الاجهزة التجريبية التي تسمح لحساب في الوقت الحقيقي من القوة المتولدة، من CMs أحادية الثقافة المصنفة على أفلام رقيقة (تعتبر الأفلام رقيقة العضلات (MTFs))9،إلى الخلايا القلبية المشاركة في الثقافة 3D المصفوفات هيدروجيل علقت بين cantilevers قائمة بذاتها (تعتبر أنسجة القلب المهندسة (EHTs))10. وقد ركزت نهج أخرى على تنفيذ تقنيات micromolding لتقليد أنيسوتروبي عضلة القلب, من CMs أحادية الثقافة في هيدروجيل 3D علقت بين microposts جاحظ في التصحيح الأنسجة11, إلى CMs أحادية الثقافة المصنفة بين microgrooves البادئة12,13. ولذلك، فإن من المناسب استخدام هذه التقنية التي تتماشى مع التطبيق المقصود والمسألة البيولوجية المقابلة له، هناك مزايا وعيوب متأصلة لكل من هذه الأساليب.
القدرة على تعزيز نضوج CMs المستمدة من الخلايا الجذعية أمر ضروري للهندسة المختبرية الناجحة للأنسجة عضلة القلب الشبيهة بالبالغين وترجمة النتائج اللاحقة إلى التفسيرات السريرية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم استكشاف أساليب لنضوج CMs على نطاق واسع، سواء في 2D و3D 14،15،16. على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي المدمج في EHTs، المحاذاة القسرية لل CMs مع تضاريس السطح، إشارات الإشارات، عوامل النمو من الثقافة المشتركة، و / أو ظروف الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد، وما إلى ذلك، كلها تؤدي إلى تغيير لصالح نضوج CM في واحد على الأقل من ما يلي: مورفولوجيا الخلايا، مناولة الكالسيوم، بنية الساركوميري، التعبير الجيني، أو القوة الانقباشية.
ومن بين هذه النماذج، تحتفظ النهج التي تستخدم منصات microfluidic بمزايا معينة في الطبيعة، مثل التحكم في التدرجات، ومحدودية إدخال الخلايا، والحد الأدنى من الكواشف اللازمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد العديد من التكرارات البيولوجية في وقت واحد باستخدام منصات microfluidic، مما يخدم لتشريح أفضل الآلية البيولوجية من الفائدة وزيادة حجم العينة التجريبية لصالح السلطة الإحصائية17،18،19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التصوير الضوئي في عملية تصنيع الجهاز microfluidic يمكن من إنشاء ميزات دقيقة (مثل الطبوغرافيات) على مستوى الدقيقة والنانو ، والتي تعمل كعظة تلسكوبية لتعزيز البنية الخلوية المحيطة وهندسة الأنسجة على المستوىالكلي18و20و21و22 للتطبيقات المختلفة في تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.
أظهرنا سابقا تطوير نموذج جديد للأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد على الشريحة يتضمن تضاريس سطحية ، في شكل أعمدة بيضاوية فطرية ، لمحاذاة خلايا القلب المشاركة في زراعة الهيدروجيل في نسيج متداخل وغير متماثل20. بعد 14 يوما من الثقافة ، تكون الأنسجة التي تشكلت داخل الجهاز microfluidic أكثر نضجا في النمط الظاهري ، وملف التعبير الجيني ، وخصائص التعامل مع الكالسيوم ، والاستجابة الصيدلانية بالمقارنة مع الضوابط أحادية الطبقة و3D isotropic23. يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقة إنشاء هذا النسق ثلاثي الأبعاد المشترك، والمنسق (أي anisotropic) أنسجة القلب البشرية داخل الجهاز microfluidic باستخدام CMs المشتقة من hiPSC. على وجه التحديد، ونحن نشرح أساليب لتمييز وتنقية hiPSCs نحو CMs، ومكملات hCFs مع CMs لإنتاج السكان الثقافة المشتركة المنشأة، وإدراج السكان الخلية مغلفة داخل هيدروجيل الكولاجين في الأجهزة microfluidic، والتحليل اللاحق للأنسجة 3D شيدت من خلال المقايسات الإنقباعي والمناعة. الأنسجة الدقيقة المهندسة ثلاثية الأبعاد الناتجة مناسبة لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسات البيولوجيا الأساسية ، والنمذجة القلبية الوعائية ، والاختبارات الصيدلانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشكيل نموذج الأنسجة القلبية البشرية في المختبر مع تعزيز التفاعلات الخلية الخلية وهيكل 3D المحاكاة الحيوية أمر حتمي للبحوث الأساسية القلب والأوعية الدموية والتطبيقات السريريةالمقابلة 1. يشرح هذا البروتوكول الموجز تطوير أنسجة القلب غير المثيلية البشرية ثلاثية الأبعاد د?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جائزة NSF CAREER #1653193، وجائزة المحقق الجديد للجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية (ABRC) (ADHS18-198872)، وجائزة مؤسسة فلين لتوفير مصادر التمويل لهذا المشروع. تم الحصول على خط hiPSC ، SCVI20 ، من جوزيف سي وو ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه في معهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية بتمويل من NIH R24 HL117756. تم الحصول على خط hiPSC ، IMR90-4 ، من معهد WiCell للأبحاث55،56.
Materials
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
References
- Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
- Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
- LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. . Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, 3-21 (2005).
- Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
- Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
- Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
- Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
- Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
- Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
- Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
- Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Recherche en cancérologie. 7, 3139-3151 (2019).
- Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
- Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
- Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
- Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
- Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
- Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
- Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells – Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
- Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
- Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
- Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
- Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
- Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
