الهدف من هذا البروتوكول هو شرح وإظهار تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للفلوريد الدقيق لأنسجة القلب البشرية المنحازة للغاية ، والمكونة من خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية التي تشارك في استزراعها مع الخلايا الليفية القلبية (CFs) داخل هيدروجيل حيوي قائم على الكولاجين ، للتطبيقات في هندسة أنسجة القلب ، وفحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض.
السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم لا يزال كما أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD). ومع ذلك ، فإن نمذجة التعقيد الفسيولوجي والبيولوجي لعضلات القلب ، عضلة القلب ، من الصعب تحقيقها في المختبر. أساسا، تكمن العقبات في الحاجة إلى خلايا القلب البشرية (CMs) التي هي إما الكبار أو تظهر الأنماط الظاهرية مثل الكبار ويمكن تكرار بنجاح تعقيد عضلة القلب الخلوية والهندسة المعمارية المعقدة 3D. لسوء الحظ ، بسبب المخاوف الأخلاقية وعدم وجود أنسجة القلب البشرية الأولية المشتقة من المريض ، إلى جانب الحد الأدنى من انتشار CMs ، كان الحصول على CMs البشرية القابلة للحياة خطوة محدودة لهندسة أنسجة القلب. وتحقيقا لهذه الغاية، تحولت معظم البحوث نحو التمايز القلبي للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hiPSCs) كمصدر رئيسي ل CMs البشرية، مما أدى إلى دمج hiPSC-CMs على نطاق واسع ضمن المقايسات المختبرية لنمذجة الأنسجة القلبية.
هنا في هذا العمل، ونحن نثبت بروتوكول لتطوير 3D ناضجة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة القلبية البشرية داخل جهاز microfluidic. نحن نشرح ونوضح بصريا إنتاج نموذج أنسجة القلب ثلاثية الأبعاد في المختبر على رقاقة من CMs المشتقة من hiPSC. نحن نصف في المقام الأول بروتوكول تنقية لتحديد ل CMs، والثقافة المشتركة للخلايا مع نسبة محددة عن طريق خلط CMs مع CFs الإنسان (hCFs)، وتعليق هذه الثقافة المشتركة داخل الهيدروجيل القائم على الكولاجين. كما أننا نثبت حقن الهيدروجيل المحمل بالخلايا داخل جهازنا الدقيق الدقيق المحدد جيدا ، المضمن مع الأعمدة البيضاوية المتداخلة التي تعمل كتدبير سطحي للحث على درجة عالية من محاذاة الخلايا المحيطة ومصفوفة الهيدروجيل ، تحاكي بنية عضلة القلب الأصلية. ونحن نتصور أن النموذج المقترح 3D الأنسجة القلبية غير المثيلة على رقاقة مناسبة لدراسات البيولوجيا الأساسية, نمذجة الأمراض, ومن خلال استخدامه كأداة فحص, اختبار الأدوية.
وقد تم استكشاف نهج هندسة الأنسجة على نطاق واسع، في السنوات الأخيرة، لمرافقة في النتائج السريرية في الجسم الحي في الطب التجديدي والنمذجة المرض1،2. وقد تم التركيز بشكل خاص على نمذجة الأنسجة القلبية في المختبر بسبب الصعوبات الكامنة في مصادر الأنسجة القلبية الأولية البشرية وإنتاج بدائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، مما يحد من الفهم الأساسي للآليات المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)1،3. وقد شملت النماذج التقليدية في كثير من الأحيان 2D مقايسات ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن أهمية زراعة خلايا القلب داخل بيئة ثلاثية الأبعاد لمحاكاة كل من المناظر الطبيعية الأصلية للقلب والتفاعلات الخلوية المعقدة قد تميزت على نطاق واسع4،5. بالإضافة إلى ذلك، شملت معظم النماذج المنتجة حتى الآن ثقافة أحادية من CMs تختلف عن الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يتكون القلب من أنواع خلايا متعددة6 داخل بنية ثلاثية الأبعاد معقدة7، مما يبرر الحاجة الماسة لتحسين تعقيد تكوين الأنسجة داخل نماذج المختبر ثلاثية الأبعاد لمحاكاة المكونات الخلوية للقلب العضلي الأصلي بشكل أفضل.
حتى الآن، تم استكشاف العديد من النهج المختلفة لإنتاج نماذج 3D المحاكاة الحيوية من عضلة القلب8. وتتراوح هذه النهج من الاجهزة التجريبية التي تسمح لحساب في الوقت الحقيقي من القوة المتولدة، من CMs أحادية الثقافة المصنفة على أفلام رقيقة (تعتبر الأفلام رقيقة العضلات (MTFs))9،إلى الخلايا القلبية المشاركة في الثقافة 3D المصفوفات هيدروجيل علقت بين cantilevers قائمة بذاتها (تعتبر أنسجة القلب المهندسة (EHTs))10. وقد ركزت نهج أخرى على تنفيذ تقنيات micromolding لتقليد أنيسوتروبي عضلة القلب, من CMs أحادية الثقافة في هيدروجيل 3D علقت بين microposts جاحظ في التصحيح الأنسجة11, إلى CMs أحادية الثقافة المصنفة بين microgrooves البادئة12,13. ولذلك، فإن من المناسب استخدام هذه التقنية التي تتماشى مع التطبيق المقصود والمسألة البيولوجية المقابلة له، هناك مزايا وعيوب متأصلة لكل من هذه الأساليب.
القدرة على تعزيز نضوج CMs المستمدة من الخلايا الجذعية أمر ضروري للهندسة المختبرية الناجحة للأنسجة عضلة القلب الشبيهة بالبالغين وترجمة النتائج اللاحقة إلى التفسيرات السريرية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم استكشاف أساليب لنضوج CMs على نطاق واسع، سواء في 2D و3D 14،15،16. على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي المدمج في EHTs، المحاذاة القسرية لل CMs مع تضاريس السطح، إشارات الإشارات، عوامل النمو من الثقافة المشتركة، و / أو ظروف الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد، وما إلى ذلك، كلها تؤدي إلى تغيير لصالح نضوج CM في واحد على الأقل من ما يلي: مورفولوجيا الخلايا، مناولة الكالسيوم، بنية الساركوميري، التعبير الجيني، أو القوة الانقباشية.
ومن بين هذه النماذج، تحتفظ النهج التي تستخدم منصات microfluidic بمزايا معينة في الطبيعة، مثل التحكم في التدرجات، ومحدودية إدخال الخلايا، والحد الأدنى من الكواشف اللازمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد العديد من التكرارات البيولوجية في وقت واحد باستخدام منصات microfluidic، مما يخدم لتشريح أفضل الآلية البيولوجية من الفائدة وزيادة حجم العينة التجريبية لصالح السلطة الإحصائية17،18،19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التصوير الضوئي في عملية تصنيع الجهاز microfluidic يمكن من إنشاء ميزات دقيقة (مثل الطبوغرافيات) على مستوى الدقيقة والنانو ، والتي تعمل كعظة تلسكوبية لتعزيز البنية الخلوية المحيطة وهندسة الأنسجة على المستوىالكلي18و20و21و22 للتطبيقات المختلفة في تجديد الأنسجة ونمذجة الأمراض.
أظهرنا سابقا تطوير نموذج جديد للأنسجة القلبية ثلاثية الأبعاد على الشريحة يتضمن تضاريس سطحية ، في شكل أعمدة بيضاوية فطرية ، لمحاذاة خلايا القلب المشاركة في زراعة الهيدروجيل في نسيج متداخل وغير متماثل20. بعد 14 يوما من الثقافة ، تكون الأنسجة التي تشكلت داخل الجهاز microfluidic أكثر نضجا في النمط الظاهري ، وملف التعبير الجيني ، وخصائص التعامل مع الكالسيوم ، والاستجابة الصيدلانية بالمقارنة مع الضوابط أحادية الطبقة و3D isotropic23. يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقة إنشاء هذا النسق ثلاثي الأبعاد المشترك، والمنسق (أي anisotropic) أنسجة القلب البشرية داخل الجهاز microfluidic باستخدام CMs المشتقة من hiPSC. على وجه التحديد، ونحن نشرح أساليب لتمييز وتنقية hiPSCs نحو CMs، ومكملات hCFs مع CMs لإنتاج السكان الثقافة المشتركة المنشأة، وإدراج السكان الخلية مغلفة داخل هيدروجيل الكولاجين في الأجهزة microfluidic، والتحليل اللاحق للأنسجة 3D شيدت من خلال المقايسات الإنقباعي والمناعة. الأنسجة الدقيقة المهندسة ثلاثية الأبعاد الناتجة مناسبة لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسات البيولوجيا الأساسية ، والنمذجة القلبية الوعائية ، والاختبارات الصيدلانية.
تشكيل نموذج الأنسجة القلبية البشرية في المختبر مع تعزيز التفاعلات الخلية الخلية وهيكل 3D المحاكاة الحيوية أمر حتمي للبحوث الأساسية القلب والأوعية الدموية والتطبيقات السريريةالمقابلة 1. يشرح هذا البروتوكول الموجز تطوير أنسجة القلب غير المثيلية البشرية ثلاثية الأبعاد د?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر جائزة NSF CAREER #1653193، وجائزة المحقق الجديد للجنة أريزونا للبحوث الطبية الحيوية (ABRC) (ADHS18-198872)، وجائزة مؤسسة فلين لتوفير مصادر التمويل لهذا المشروع. تم الحصول على خط hiPSC ، SCVI20 ، من جوزيف سي وو ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه في معهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية بتمويل من NIH R24 HL117756. تم الحصول على خط hiPSC ، IMR90-4 ، من معهد WiCell للأبحاث55،56.
0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
EDTA | VWR | 45001-122 | |
Ethanol | |||
FGM3 | VWR | 10172-048 | |
GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
Glycine | Sigma | G8898-500G | |
Goat serum | VWR | 10152-212 | |
hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
IPA | |||
IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
MTCS | Sigma | 440299-1L | |
NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
EVG620 Aligner | EVG | ||
Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
Leica SP8 Confocal microscope | Leica |