Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden
Summary
Dieses Protokoll zur Immunfluoreszenzmarkierung sowohl von Pflanzenvirusproteinen als auch von Vektorinsektenproteinen in herausgeschnittenen Insektendärmen kann verwendet werden, um Interaktionen zwischen Virus- und Vektorinsekten, Insektenproteinfunktionen und molekulare Mechanismen, die der Virusübertragung zugrunde liegen, zu untersuchen.
Abstract
Die meisten Pflanzenviren in der Natur werden durch Hemipteran-Insekten von einer Pflanze auf eine andere übertragen. Eine hohe Populationsdichte der Vektorinsekten, die bei der Virusübertragung hocheffizient sind, spielt eine Schlüsselrolle bei Virusepidemien auf Feldern. Die Untersuchung von Virus-Insekten-Vektorinteraktionen kann unser Verständnis von Virusübertragung und Epidemien verbessern, mit dem Ziel, neuartige Strategien zur Bekämpfung von Pflanzenviren und ihren Vektorinsekten zu entwickeln. Die Immunfluoreszenzmarkierung ist weit verbreitet, um Interaktionen zwischen Krankheitserregern und Wirten zu analysieren, und wird hier in der Weißrücken-Zikade (WBPH, Sogatella furcifera) verwendet, die das südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae) effizient überträgt, um die Virionen und Insektenproteine in den Epithelzellen des Mitteldarms zu lokalisieren. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die morphologischen Eigenschaften von Mitteldarmepithelzellen, die zelluläre Lokalisation von Insektenproteinen und die Kolokalisation von Virionen und einem Insektenprotein. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Virusaktivitäten in Insekten, Funktionen von Insektenproteinen und Wechselwirkungen zwischen Virus und Vektorinsekt zu untersuchen.
Introduction
Die meisten beschriebenen Pflanzenviren werden durch Insekten aus der Ordnung Hemiptera übertragen, zu der Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse 1,2 gehören. Die stechend-saugenden Mundwerkzeuge von Hemipteran-Insekten durchbohren das Pflanzengewebe, um Speichel zu füttern und abzusondern, wodurch das Virus gleichzeitig effizient übertragenwird 2. Verschiedene Übertragungsmechanismen von Pflanzenviren durch Vektorinsekten wurden beschrieben. Dazu gehören nonpersistent, semipersistent und persistent. Der persistente Typ ist entweder nicht-propagativ oder propagativ3,4, aber für beide Typen muss sich das übertragene Virus durch den Körper des Insekts bewegen. Im persistent-propagativen Modus infizieren und vermehren sich Viren zunächst in den Epithelzellen des Darms des Insekts, verbreiten sich dann in verschiedenen Geweben und schließlich in den Speicheldrüsen, von wo aus sie dann während der Insektenfütterung über den Speichel in eine Pflanze eingeführt werdenkönnen 5,6. Persistente übertragene Viren bewegen sich durch verschiedene Organe und replizieren sich in ihren Insektenvektoren, was spezifische Wechselwirkungen zwischen Virus- und Vektorkomponenten in verschiedenen Stadien erfordert 7,8.
Virale Proteine und Insektenproteine müssen interagieren, um kritische Prozesse für die Viruserkennung, -infektion, -replikation oder -verbreitung in den Vektorinsektenzu erleichtern 9,10. Obwohl die optische Mikroskopie verwendet werden kann, um zelluläre Strukturen in Insekten zu beobachten, kann sie keine Virionverteilung, zelluläre Lokalisation oder Kolokalisation von viralen Proteinen und Insektenproteinen oder die Ultrastruktur von Insektengeweben und -zellen zeigen. Die Immunfluoreszenzmarkierung wurde zuerst von Coons et al. in den phagozytischen Zellen der Maus mittels Markierung spezifischer Fluorescein-Antikörper durchgeführt und ist heute weit verbreitet11. Die Immunfluoreszenztechnik, auch bekannt als Fluoreszenz-Antikörper-Technik, ist eine der frühesten immunologischen Markierungstechniken und basiert auf der spezifischen Bindungsreaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper11,12. Der bekannte Antikörper wird zunächst mit Fluorescein markiert, das als Sonde zum Nachweis der entsprechenden Antigene in den Zellen oder Geweben verwendet wird13,14. Nachdem der Fluorescein-markierte Antikörper an das entsprechende Antigen in Zellen oder Geweben gebunden hat, emittiert die Sonde eine helle Fluoreszenz, wenn sie mit Anregungswellenlängen bestrahlt und mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wird, um das Antigen15 zu lokalisieren.
Die meisten Vektorinsekten von Pflanzenviren sind Hemipteren. Eine höhere Populationsdichte von Vektorinsekten, die eine hohe Übertragungseffizienz für das Pflanzenvirus aufweisen, kann zu Virusepidemien führen5. Das Südliche Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV, Gattung Fijivirus, Familie Reoviridae), einer der schwerwiegendsten Erreger von Reis, hat sich in den Reisanbaugebieten in Ost- und Südostasien rasch ausgebreitet und seit 2010 schwere Ertragseinbußen verursacht16,17. Erwachsene und Nymphen der Weißrückenzikade (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) übertragen SRBSDV persistent-propagativ mit hoher Effizienz auf Reis. Feldstudien haben gezeigt, dass Ausbrüche der SRBSDV-induzierten Reisschwarzstreifen-Zwergkrankheit in der Regel mit einer Massenmigration von WBPHs über große Entfernungen zusammenfallen, einem entscheidenden Faktor bei SRBSDV-Epidemien 7,8,18. Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) ist ein löslicher N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-Bindungsprotein-Rezeptor (SNARE), der den Transport von Substanzen durch Vesikelfusion vermitteln kann. VAMP7 interagiert in vitro mit dem äußeren Hauptkapsidprotein von SRBSDV, was darauf hindeutet, dass VAMP7 eng mit der Virusübertragung assoziiert sein könnte16.
In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir den Darm aus viruliferem WBPH herausgeschnitten, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Mitteldarmepithelzellenzu markieren 16. Als erste Invasionsstelle des Virus spielt das Mitteldarmepithel eine wichtige Rolle bei der Infektion, Replikation und Übertragung von Viren. Zuerst haben wir die Schritte beschrieben, um den Darm von Nymphen und Erwachsenen von WBPHs zu entfernen. Zweitens verwendeten wir spezifische Fluorescein-markierte Antikörper, um SRBSDV-Virionen und VAMP7 in Darmepithelzellen zu markieren. Dann beobachteten wir Epithelzellen und die zelluläre Lage der Virionen und VAMP7 über ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse zeigten, dass SRBSDV-Virionen und VAMP7 im Zytoplasma der Mitteldarmepithelzellen kolokalisieren können, was darauf hindeutet, dass die spezifische Funktion von VAMP7 mit der Verbreitung von Virionen aus Mitteldarmepithelzellen zusammenhängen könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten einige wichtige Punkte beachtet werden. Erstens ist ein hoher Anteil viruliferer Insekten an der Gesamtpopulation notwendig. Obwohl der minimale AAP für SRBSDV durch WBPH-Nymphen und Erwachsene 5 min17 beträgt, sollten die Insekten 2 Tage lang von frischen SRBSDV-infizierten Reispflanzen gefressen werden, um eine Erfassungseffizienz von bis zu 80% zu erreichen. Da die SRBSDV-Virionen in 80% des Mitteldarms nachgewiesen werden können<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31630058 an X.W. und 31772134 an W.L.) unterstützt.
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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