半翅目腸内における植物ウイルスおよび昆虫ベクタータンパク質の免疫蛍光標識
Summary
切除された昆虫の腸における植物ウイルスタンパク質とベクター昆虫タンパク質の両方の免疫蛍光標識のためのこのプロトコルは、ウイルスとベクター昆虫の間の相互作用、昆虫タンパク質の機能、およびウイルス感染の根底にある分子メカニズムを研究するために使用できます。
Abstract
自然界のほとんどの植物ウイルスは、半翅目の昆虫によってある植物から別の植物に伝染します。ウイルス感染に非常に効率的な媒介昆虫の高い個体群密度は、野外でのウイルス流行において重要な役割を果たします。ウイルスと昆虫のベクター相互作用を研究することで、ウイルスの伝播と流行の理解を深め、植物ウイルスとそのベクター昆虫を制御するための新しい戦略を設計することができます。免疫蛍光標識は、病原体と宿主との相互作用を分析するために広く使用されており、ここでは、ミナミイネクロインジグサドワーフウイルス(SRBSDV、フィジウイルス属、レオウイルス科)を効率的に伝達するシロウンカ(WBPH、Sogatella furcifera)で使用され、中腸上皮細胞内のビリオンと昆虫タンパク質を特定します。レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、中腸上皮細胞の形態学的特徴、昆虫タンパク質の細胞局在、およびビリオンと昆虫タンパク質の共局在を調べました。このプロトコルは、昆虫のウイルス活動、昆虫タンパク質の機能、およびウイルスとベクター昆虫の相互作用を研究するために使用できます。
Introduction
記載されているほとんどの植物ウイルスは、アブラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ウンカ、アザミウマを含む半翅目からの昆虫によって伝染します1,2。半翅目昆虫の穿刺吸引口部は、唾液を摂食および分泌するために植物組織を突き刺し、同時にウイルス2を効率的に伝達する。ベクター昆虫による植物ウイルスの異なる伝播メカニズムが説明されています。これらには、非永続的、半永続的、および永続的が含まれます。永続的なタイプは非繁殖型または繁殖型のいずれかですが、これらのタイプの両方について、感染したウイルスは昆虫の体内を移動する必要があります。持続繁殖モードでは、ウイルスは最初に昆虫の腸の上皮細胞に感染して複製し、次にさまざまな組織に拡散し、最終的には唾液腺に播種し、そこから昆虫の摂食中に唾液を介して植物に導入できます5,6。持続性感染ウイルスは、異なる器官を通って移動し、昆虫媒介物内で複製するため、異なる段階でウイルスとベクター成分間の特異的相互作用が必要である7,8。
ウイルスタンパク質および昆虫タンパク質は、ベクター昆虫におけるウイルス認識、感染、複製、または播種のための重要なプロセスを促進するために相互作用しなければならない9,10。光学顕微鏡は昆虫の細胞構造を観察するために使用できますが、ウイルス粒子分布、ウイルスタンパク質と昆虫タンパク質の細胞局在または共局在、または昆虫組織と細胞の超微細構造を示すことはできません。免疫蛍光標識は、Coonsらによってマウスの食細胞において、特異的なフルオレセイン抗体を標識することによって最初に行われ、現在では広く使用されている11。蛍光抗体法としても知られる免疫蛍光法は、開発された最も初期の免疫学的標識技術の1つであり、抗原と抗体との間の特異的結合反応に基づいている11,12。既知の抗体は、まずフルオレセインで標識され、フルオレセインは、細胞または組織13、14における対応する抗原を検出するためのプローブとして使用される。フルオレセイン標識抗体が細胞または組織内の対応する抗原に結合した後、励起波長を照射し、蛍光顕微鏡で観察して抗原15を局在化すると、プローブは明るい蛍光を発します。
植物ウイルスのほとんどの媒介昆虫は半翅目です。植物ウイルスの伝播効率が高い媒介昆虫の個体群密度が高いと、ウイルスの流行につながる可能性があります5。イネの最も深刻な病原体の1つであるミナミイネブラックストリークドワーフウイルス(SRBSDV、フィジウイルス属、レオウイルス科)は、東アジアと東南アジアの稲作地域に急速に広がり、2010年以降深刻な収量損失を引き起こしました16,17。シロウンカ(WBPH、Sogatella furcifera Horváth)の成虫と幼虫は、SRBSDVを持続的繁殖性で高効率でイネに伝達します。現地調査によると、SRBSDV誘発性のイネ黒縞矮性病の発生は、通常、SRBSDVの流行の重要な要因であるWBPHの大量長距離移動と一致することが示されています7,8,18。小胞関連膜タンパク質7(VAMP7)は、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(SNARE)であり、小胞融合を介した物質の輸送を媒介することができます。VAMP7はインビトロでSRBSDVの外側の主要キャプシドタンパク質と相互作用し、これはVAMP7がウイルス感染と密接に関連している可能性があることを示しています16。
ここに提示したプロトコールでは、中腸上皮細胞16においてSRBSDVビリオンおよびVAMP7を標識する例として、ウイルス性WBPHから腸を摘出した。ウイルスの最初の侵入部位として、中腸上皮はウイルスの感染、複製、および伝播において重要な役割を果たします。まず、WBPHのニンフと成体から腸を切除する手順を詳しく説明しました。次に、特異的フルオレセイン標識抗体を使用して、腸上皮細胞のSRBSDVビリオンとVAMP7を標識しました。次に、上皮細胞とビリオンとVAMP7の細胞位置をレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察しました。その結果、SRBSDVビリオンとVAMP7が中腸上皮細胞の細胞質に共局在し、VAMP7の特異的な機能が中腸上皮細胞からのビリオンの播種に関連している可能性が示唆された。
Protocol
Representative Results
Discussion
最良の結果を得るには、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。第一に、総人口に占めるウイルス性昆虫の割合が高いことが必要です。WBPHニンフと成虫によるSRBSDVの最小AAPは5分17ですが、最大80%の獲得効率を達成するために、昆虫は新鮮なSRBSDVに感染したイネを2 d食べさせる必要があります。SRBSDVビリオンは中腸の80%で検出できるため18、このプ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団からの助成金(31630058からX.W.および31772134 W.L.)によってサポートされました。
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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