Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels
Summary
Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.
Abstract
Les glandes salivaires sont une cible tissulaire attrayante pour la thérapie génique avec des résultats prometteurs menant déjà à des essais sur l’homme. Ils sont intrinsèquement capables de sécrétion de protéines dans la circulation sanguine et sont facilement accessibles, ce qui en fait des sites tissulaires potentiellement supérieurs pour la production d’hormones de remplacement ou la vaccination par transfert de gènes. Les méthodes suggérées pour l’administration de gènes comprennent l’injection transcutanée et la perfusion rétrograde par les canaux salivaires. Nous démontrons comment effectuer une perfusion rétrograde de glandes salivaires (RSGI) chez des primates non humains. Nous décrivons les points de repère anatomiques importants, y compris l’identification de la papille parotide, une méthode atraumatique de canulation et de scellement du conduit de Stensen à l’aide d’outils dentaires de base, de tubes en polyéthylène et de cyanoacrylate, et le taux de perfusion approprié. Bien qu’il s’agisse de la méthode d’accouchement la moins traumatisante, la méthode est encore limitée par le volume pouvant être délivré (<0,5 mL) et le risque de traumatisme du canal et de la glande. Nous démontrons par fluoroscopie qu’un infusate peut être entièrement délivré dans la glande, et démontrons en outre par immunohistochimie la transduction d’un vecteur typique et l’expression du gène délivré.
Introduction
Alors que les glandes salivaires sont bien connues pour leur production exocrine de salive, les chercheurs ont depuis longtemps reconnu leur capacité à sécrétionner des protéines directement dans la circulation sanguine1,ce qui en fait une cible potentielle pour la thérapie génique pour l’administration systémique, comme les hormones de remplacement ou la production d’anticorps. En fait, les glandes salivaires offrent plusieurs avantages par rapport à d’autres cibles tissulaires, tels que la capacité inhérente à produire des protéines pour la sécrétion (une propriété qui manque aux muscles), une encapsulation lourde qui peut limiter la diffusion des vecteurs et des tissus bien différenciés assurant la stabilité des vecteurs non intégrateurs. De plus, en cas d’événement indésirable grave, les glandes salivaires ne sont pas critiques pour la vie et peuvent être enlevées chirurgicalement. Bien qu’elles ne soient pas immédiatement intuitives, les glandes parotides sont également facilement accessibles depuis la bouche par leur principal canal excréteur, le canal2de Stensen.
Compte tenu des avantages du tissu salivaire pour la thérapie génique, il y a un intérêt croissant pour l’exploration de cette cible tissulaire. De nombreuses études ont déjà été réalisées sur des modèles de primates rongeurs, canins et non humains et au moins un essai clinique humain est en cours3,4,5. Pour explorer et développer davantage l’utilité de cette cible tissulaire à des fins de thérapie génique, d’autres études sur les primates non humains devront être effectuées. Cet article décrit une méthode d’accès aux glandes parotides par le canal de Stensen pour délivrer un gène vectoriel de transduction dans le modèle de primate non humain. Pour démontrer visiblement l’administration de l’infusate et l’anatomie du canal lorsqu’il pénètre dans la glande, une fluoroscopie à l’aide d’un radiocontraste a été effectuée. Pour démontrer la transduction réussie d’un vecteur, un gène egfp vectoriel adénovirus de sérotype 5 (Ad5) a été utilisé. Ad5 est un vecteur bien décrit capable de transduire le tissu salivaire. Bien qu’il soit trop immunogène pour une utilisation clinique finale, un vecteur Ad5 a été choisi pour cette étude de démonstration afin d’assurer une transduction efficace. L’évaluation de la production de protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) est une méthode bien décrite pour démontrer la transcription et la traduction réussies d’un gène vectoriel après la transduction et a été réalisée ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole d’infusion rétrograde dans la glande parotide à travers le canal de Stensen. La méthodologie décrite offre des conseils qui peuvent potentiellement être utilisés par les chercheurs qui explorent l’utilité du tissu salivaire en tant que site pour la thérapie génique et d’autres applications.
Il existe plusieurs étapes critiques pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, toutes les étapes de la procédure doivent être complétées…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier M. Cagney Gentry pour son soutien audiovisuel dans le tournage de la procédure. Nous tenons également à remercier le centre médical Hefner VA pour son soutien académique dans la poursuite de ce projet.
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
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