ベクター化遺伝子導入のための非ヒト霊長類におけるステンセンダクトによる逆行性耳下腺注入
Summary
唾液腺は、遺伝子治療の組織標的部位として、特に遺伝子導入によるワクチン接種の領域において提案されている。逆行性の耳下腺注入を利用した非ヒト霊長類モデルにおける遺伝子導入を実証する。
Abstract
唾液腺は、すでにヒトの試験につながる有望な結果を有する遺伝子治療のための魅力的な組織標的である。彼らは本質的に血流中にタンパク質を分泌することができ、容易にアクセス可能であり、遺伝子導入による置換ホルモン産生またはワクチン接種のための潜在的に優れた組織サイトを作る。遺伝子導入の推奨方法としては、唾液管を介した経皮注射および逆行注入が挙げられる。ヒト以外の霊長類で逆行唾液腺注入(RSGI)を行う方法を実演する。我々は、耳下腺乳頭の同定、基本的な歯科用具、ポリエチレンチューブ、シアノアクリル酸塩を利用したステンセンのダクトをカニューララットおよびシールする無外傷性方法、および適切な注入速度を含む重要な解剖学的ランドマークを記述する。これは最も外傷性の低い送達方法ですが、この方法は、引き渡し可能な体積(<0.5 mL)と、ダクトおよび腺への外傷の可能性によって依然として制限されています。蛍光検査を用いて、蛍光検査を用いて、インフューズトを完全に腺に送達できることを実証し、免疫体系化学によって、典型的なベクターの導入と、送達された遺伝子の発現を更に実証する。
Introduction
唾液腺は唾液の外分泌産生でよく知られていますが、研究者は長い間、タンパク質を血流1に直接分泌する能力を認識しており、置換ホルモンや抗体産生などの全身投与のための遺伝子治療の潜在的な標的となっています。実際、唾液腺は、分泌のためのタンパク質を産生する固有の能力(プロパティ筋不足)、ベクター拡散を制限できる重いカプセル化、非統合ベクターの安定性を提供する十分に分化された組織など、他の組織ターゲットに対していくつかの利点を提供します。さらに、重篤な有害事象が発生した場合、唾液腺は生命にとって重要ではなく、外科的に除去することができる。直ちに直ぐには直視できないが、耳下腺は口から主な排泄管、ステンセンのダクト2を通して容易にアクセスできる。
遺伝子治療のための唾液組織の利点を考えると、この組織標的を探索することに関心が高まっている。げっ歯類、イヌ、ヒト以外の霊長類モデルでは既に数多くの研究が行われ、少なくとも1つのヒト臨床試験が3、4、5で進行中である。遺伝子治療目的のためにこの組織標的の有用性をさらに探求し、開発するためには、より多くの非ヒト霊長類研究が行われる必要がある。本論文では、Stensenのダクトを介して、アオシド腺にアクセスし、非ヒト霊長類モデルにおける形質導入のためのベクター化遺伝子を送達する方法について述べている。腺に入る場合のインフューズートの送達及びダクトの解剖学を目に見えて実証するために、放射コントラストを用いた蛍光視が行われた。ベクターの正常な伝達を実証するために、アデノウイルス血清型5(Ad5)ベクター化egfp遺伝子を用いた。Ad5は、唾液組織を導入し得る、よく説明したベクターである。究極の臨床使用には免疫原性が高すぎるが、効率的な導入を保証するためにこの実証研究のためにAd5ベクターが選ばれた。強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の生産を評価することは、転写後のベクター遺伝子の転写と翻訳を成功させたことを実証するためのよく説明された方法であり、ここで行われました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ステンセンのダクトを介して耳下腺への逆行注入のプロトコルについて説明します。説明された方法論は、遺伝子治療やその他のアプリケーションの部位として唾液組織の有用性を探求する研究者によって潜在的に使用することができるガイダンスを提供する。
この手順を成功させるためには、複数の重要な手順があります。まず第一に、すべての手順は穏?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、手順の撮影における彼の視聴覚サポートのためにキャグニー・ジェントリー氏に感謝したいと考えています。また、このプロジェクトを追求するヘフナーVA医療センターの学術支援を認めたいと考えています。
Materials
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
