JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.

Abstract

المعززات هي منصات ملزمة لمجموعة متنوعة من عوامل النسخ التي تقود أنماط تعبير محددة للجينات الخاصة بالأنسجة والخلايا. أثبتت الوسائل المتعددة لتقييم الحمض النووي غير المشفر وحالات الكروماتين المختلفة فائدتها في التنبؤ بوجود تسلسلات معززة في الجينوم ، ولكن التحقق من صحة نشاط هذه التسلسلات وإيجاد الأعضاء ومراحل النمو التي تنشط فيها هي عملية كثيفة العمالة. مكنت التطورات الحديثة في ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) من توصيل جينات التحوير على نطاق واسع إلى أنسجة الفئران ، مما مكن من اختبار محسن في الجسم الحي دون الحاجة إلى معدل وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام بنية المراسل التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج ، والتي لا تقود تعبيرا مهما من تلقاء نفسها ، لدراسة أنماط نشاط تسلسل محسن المرشح في دماغ الفأر. يتم تسليم بناء مراسل معبأ AAV إلى دماغ الفأر وحضنه لمدة 1-4 أسابيع ، وبعد ذلك يتم التضحية بالحيوان ، ويتم ملاحظة أقسام الدماغ تحت المجهر. يظهر EGFP في الخلايا التي يكون فيها المحسن الذي تم اختباره كافيا لبدء التعبير الجيني ، مع تحديد الموقع ومرحلة النمو التي ينشط فيها المحسن في الدماغ. إن طرق الاستنساخ القياسية ، وتغليف AAV منخفض التكلفة ، وتوسيع الأنماط المصلية AAV وطرق التوصيل في الجسم الحي وقراءات التصوير القياسية تجعل هذا نهجا متاحا لدراسة كيفية تنظيم التعبير الجيني في الدماغ.

Introduction

المعززات هي عناصر تنظيمية جينومية لرابطة الدول المستقلة تعمل كمواقع ربط عامل النسخ ويمكنها دفع التعبير عن الجين المستهدف بطريقة محددة زمانيا مكانيا 1,2. وهي نشطة بشكل تفاضلي في أنواع الخلايا والأنسجة ومراحل التطور المختلفة ويمكن أن تكون ركائز للاختلاف الجينومي المرتبط بمخاطر المرض 3,4. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى فهم ديناميكيات وظيفة المحسن أمر بالغ الأهمية للتقدم في كل من التطبيقات العلمية الانتقالية والأساسية في علم الجينوم. في السيليكو ، يمكن أن تكون تنبؤات نشاط المحسن بمثابة موارد ممتازة لتوليد فرضيات حول قدرة المحسن 5,6. يمكن أن يتطلب نشاط المحسن المتوقع هذا التحقق والاستجواب الإضافي لفهم كامل للنشاط الوظيفي. أثبتت فحوصات مراسل Enhancer أنها ذات قيمة لهذا الغرض عبر مجموعة متنوعة من الأنظمة ، من الخلايا إلى الحيوانات7،8،9. من أجل توسيع هذه الدراسات في سياق عابر مرن وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الأساليب القائمة على AAV في الجسم الحي لاختبار تسلسلات المحسن المفترض لقدرتها على دفع التعبير عن جين مراسل خارج الرحم في دماغ الفأر بعد الولادة. هذه المجموعة من الأساليب لها فائدة لاستجواب تسلسل مرشح واحد أو فحص المكتبة المتوازي وهي ذات صلة بالبحوث الأساسية والانتقالية.

تجمع هذه الطريقة في بلازميد واحد تسلسل الحمض النووي المرشح المفترض مع جين مراسل (هنا EGFP) ، تحت سيطرة مروج الحد الأدنى الذي وحده لا يقود تعبيرا مهما. يتم تعبئة البلازميد في AAV المؤتلف (rAAV) وحقنه في نموذج حيواني. في حين أن التطبيق هنا هو الدماغ ، فإن الأنماط المصلية المختلفة rAAV تمكن العدوى عبر أنواع الأنسجة المختلفة بحيث يمكن توسيع هذا النهج ليشمل أنظمة أخرى10. بعد فترة من الزمن ، يمكن جمع الدماغ وفحصه للتعبير عن جين المراسل. يشير التعبير القوي ، مقارنة بالضوابط ، إلى أن تسلسل المرشح الذي تم اختباره كان قادرا على “تعزيز” التعبير عن الجين (الشكل 1). يوفر هذا التصميم البسيط نهجا سهلا وواضحا لاختبار تسلسل لنشاط المحسن في الجسم الحي في الدماغ.

بالإضافة إلى اختبار قدرة المحسن للتسلسل ، يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات لتحديد نشاط محسن نوع الخلية. في النهج القائمة على التسلسل لتحديد نشاط المحسن التفاضلي ، يمكن أن يسمح فرز الخلايا على علامات خاصة بنوع الخلية قبل تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي للباحثين بتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تظهر نشاط محسن تفاضلي ، كما هو موضح في Gisselbrecht et al.11. في النهج القائمة على التصوير ، يسمح وضع العلامات المشتركة للصور مع علامات خاصة بنوع الخلية بفحص ما إذا كانت الخلايا التي تظهر مضان مدفوع بالمحسن تعرض أيضا علامات من نوع الخلية ذات الأهمية12،13،14،15،16. تتيح مقايسات مراسل المحسن الاختبار المباشر للتباين الأليل المرتبط بالمخاطر في المعززات للتأثيرات على قدرة المحسن. تقع الغالبية العظمى من مواقع الخطر المحددة في دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) في مناطق غير مشفرة من الجينوم17. تشير دراسات التعليقات التوضيحية الوظيفية لمواقع المخاطر هذه إلى أن جزءا كبيرا من المحتمل أن يعمل كمحسنات18،19،20. يمكن أن يسمح نشر MPRA في الجسم الحي باختبار هذه المتغيرات المرتبطة بالمخاطر لنشاط المحسن في الدماغ12,21. أخيرا ، يمكن أن يقدم التسليم والتجميع في نقاط زمنية مختلفة نظرة ثاقبة لمراحل التطور التي يكون خلالها المحسن نشطا.

تصميمات البلازميد المحسنة-المراسل متنوعة ويمكن تخصيصها لتناسب الأهداف التجريبية. هناك العديد من الخيارات للحد الأدنى من المروجين التي تم استخدامها في أبحاث المحسن ، مثل المروج الأدنى β-globinالبشري 22 والماوس Hsp68 الحد الأدنى من المروج23. من المعروف أن هؤلاء المروجين يقودون مستويات منخفضة من التعبير ما لم يقترن بعنصر محسن لتنشيطهم. في المقابل ، تدفع عناصر المروج التأسيسية تعبيرا قويا عن جين التحوير ، وهو مفيد للتحكم الإيجابي أو لاختبار وظيفة المحسن على خلفية التعبير القوي. تشمل الخيارات الشائعة للمروجين التأسيسيين CAG ، وهو مروج هجين مشتق من مروج الدجاج β الأكتين ومحسن الفيروس المضخم للخلايا الفوريالمبكر 24 ، أو EF1α25 البشري. نظرا لأنه من المعروف أن المعززات تعمل ثنائي الاتجاه26 ، فإن اتجاه وموقع المحسن بالنسبة إلى الحد الأدنى من المروج مرن (الشكل 2 أ). تضع مقايسات المحسن والمراسل التقليدية المحسن في المنبع للمروج ، وفي عمليات تسليم المكتبة ، تتضمن تسلسل الباركود في اتجاه مجرى جين المراسل لربط قراءات التسلسل بالمحسنالمختبر 27. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع المعززات في إطار القراءة المفتوح لجين المراسل وتعمل كتسلسل باركود خاص بها ، كما هو الحال في STARR-seq28. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا تصميم مقايسة STARR-seq ، مما يضع تسلسل محسن المرشح في 3 ‘UTR لجين المراسل. في حين أن اتجاه STARR-seq يوفر ميزة الاستنساخ الأكثر انسيابية ، إلا أنه أقل فهما من النهج التقليدي وقد يؤدي إلى استقرار متغير للحمض النووي الريبي بين البنى. يمكن تكييف الطرق الموصوفة بسهولة إما مع STARR-seq أو الاتجاه التقليدي مع تعديلات طفيفة على عملية الاستنساخ التي تم وصفها في مكان آخر27,29.

يمكن استخدام طرق مختلفة لتسليم AAV لزيادة تخصيص هذه التقنية لتناسب الأهداف التجريبية (الشكل 2 ب). الحقن المباشر داخل الجمجمة ، الموصوف بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول ، يقدم تركيزا عاليا من الفيروس مباشرة إلى الدماغ30. وهذا يعطي كفاءة نقل عالية تتمركز في موقع الحقن ، مما يجعل هذه تقنية ممتازة للتجارب التي تتطلع إلى زيادة كثافة الخلايا المنقولة إلى أقصى حد على مساحة من الأنسجة. يمكن أن يساعد الحقن التجسيمي في توحيد موقع الحقن عبر الحيوانات من أجل النقل الموضعي القابل للتكرار. الحقن داخل الجمجمة هي الأكثر وضوحا في الحيوانات بعد الولادة المبكرة. كتقنية بديلة ، يمكن للحقن الجهازية توصيل جينات التحوير باستخدام AAVs مع الأنماط المصلية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي31. تسمح حقن الوريد الذيل للفيروس بالانتشار في جميع أنحاء الجسم ، مما يتيح التوصيل المعمم عبر العديد من الأنسجة10. الحقن المداري الخلفي هي تقنية حقن جهازية أخرى توصل الفيروس خلف العين إلى الجيب المداريالخلفي 32. يوفر هذا طريقا مباشرا أكثر ل AAV من الجهاز الوريدي إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى للخلايا المنقولة في الدماغ مقارنة بالحقن في المزيد من الأوعية الدموية المحيطية33.

جانب مرن آخر لهذه التقنية هو طريقة القراءة. بشكل عام ، يمكن وصف الخيارات بأنها قائمة على المراسل أو قائمة على التسلسل (الشكل 2 ج). يؤدي دمج مراسل فلوري مثل GFP في إطار القراءة المفتوح للبناء إلى التعبير عن البروتين الفلوري في أي خلايا محولة حيث قاد المحسن المرشح التعبير. تتيح تقنيات وضع العلامات والتصوير مثل الكيمياء المناعية تضخيم الإشارة. تتضمن تقنيات القراءة القائمة على التسلسل تحديد التسلسلات من البنية المسلمة في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من الأنسجة. من خلال تحديد كمية الحمض النووي الفيروسي التي تم تسليمها في البداية ، يمكن استخدام مقارنة الحمض النووي الريبي المعبر عنه مقابل الحمض النووي المنقول لتحديد الدرجة التي كان بها تسلسل محسن تم اختباره قادرا على زيادة التعبير عن جين التحوير ، على سبيل المثال ، في سياق مقايسة مراسل موازية على نطاق واسع (MPRA). تقدم MPRAs توسعا قويا لهذه التقنيات لاختبار ما يصل إلى الآلاف من المعززات المرشحة للنشاط في وقت واحد وقد تم وصفها على نطاق واسع في أبحاث الجينوم12،27،34،35،36. يتم تحقيق فحص إنتاجية أعلى من خلال تنفيذ خطوات الاستنساخ والتعبئة والتسليم والتسلسل للمحسنات المرشحة دفعة واحدة وليس بشكل فردي.

يوفر اختيار محسن المرشح فرصة أخرى للمرونة (الشكل 2D). على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد معززات جين معين ، للتأكد من وظيفة مناطق الحمض النووي غير المشفرة ذات الأهمية ، أو لتحديد أنواع معينة من الخلايا أو مراحل النمو التي يكون خلالها المحسن نشطا – وكلها تخدم أهدافا في كل من العلوم الأساسية وأبحاث الأمراض. بشكل عام ، يكون اختيار محسن المرشح مدفوعا بتنبؤات السيليكو لنشاط المحسن. بشكل عام ، في تنبؤات السيليكو تشمل ChIP-seq لتعديلات هيستون التي تشير إلى معززات محتملة ، مثل H3K27ac37 ورسم خرائط إمكانية الوصول إلى الكروماتين38. أخيرا ، هناك مجال متزايد للبحث هو الفحص القائم على الوظيفة لعناصر المحسن المصممة صناعيا ، مما يتيح إجراء دراسات حول كيفية توجيه تسلسل المحسن للوظيفة39 وتصميم المعززات ذات الخصائص المحددة40.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (البروتوكول # 22339) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (BUA-R1903). تم اختبار هذا البروتوكول على الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين في يوم ما بعد الولادة 0-1. …

Representative Results

باستخدام هذه الطرق ، تم اختبار تسلسل 915 bp في الإنترون الثالث المرتبط بالمخاطر النفسية للجين CACNA1C19،49،50 لنشاط محسن في دماغ الفأر بعد الولادة. تم اكتشاف هذا التسلسل في MPRA من 345 تسلسلا محسنا مرشحا يركز على المخاطر النفسية والعصبية SNPs<sup clas…

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على rAAV لنشر جينات التحوير التي يحركها المحسن في دماغ الفأر بعد الولادة. في هذا البروتوكول المعمم ، يتم استنساخ محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، وتسلسل باركود اختياري في العمود الفقري البلازميد AAV. يمكن إجراء هذه التجارب باستخدام تسلسل محسن مرشح واحد أو ب?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم إجراء التسلسل في مركز تقنيات الحمض النووي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. نشكر مختبر لين تيان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس على التدريب على تغليف rAAV وإهدائنا بسخاء مساعد AAV وبلازميدات مندوب / غطاء. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain
check_url/fr/62650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image