JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Despliegue de AAV de construcciones de expresión basadas en potenciadores in vivo en cerebro de ratón

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Este protocolo describe un nuevo ensayo de potenciador transitorio-reportero basado en rAAV. Este ensayo se puede utilizar para inducir la expresión impulsada por potenciadores in vivo en el cerebro del ratón.

Abstract

Los potenciadores son plataformas de unión para una amplia gama de factores de transcripción que impulsan patrones de expresión específicos de genes específicos de tejidos y tipos de células. Múltiples medios para evaluar el ADN no codificante y varios estados de cromatina han demostrado ser útiles para predecir la presencia de secuencias potenciadoras en el genoma, pero validar la actividad de estas secuencias y encontrar los órganos y las etapas de desarrollo en las que están activos es un proceso laborioso. Los avances recientes en vectores de virus adenoasociados (AAV) han permitido la entrega generalizada de transgenes a tejidos de ratón, lo que permite realizar pruebas de potenciadores in vivo sin necesidad de un animal transgénico. Este protocolo muestra cómo una construcción reportera que expresa EGFP bajo el control de un promotor mínimo, que no impulsa una expresión significativa por sí sola, puede usarse para estudiar los patrones de actividad de las secuencias de potenciadores candidatos en el cerebro del ratón. Una construcción de reportero empaquetada con AAV se entrega al cerebro del ratón y se incuba durante 1-4 semanas, después de lo cual se sacrifica al animal y se observan secciones cerebrales bajo un microscopio. EGFP aparece en células en las que el potenciador probado es suficiente para iniciar la expresión génica, señalando la ubicación y la etapa de desarrollo en la que el potenciador está activo en el cerebro. Los métodos de clonación estándar, el empaquetado de AAV de bajo costo y la expansión de los serotipos de AAV y los métodos para la administración in vivo y la lectura de imágenes estándar hacen de este un enfoque accesible para el estudio de cómo se regula la expresión génica en el cerebro.

Introduction

Los potenciadores son elementos genómicos cis-reguladores que sirven como sitios de unión al factor de transcripción y pueden conducir la expresión de un gen diana de una manera espacio-temporal específica 1,2. Son diferencialmente activos en diferentes tipos celulares, tejidos y etapas de desarrollo y pueden ser sustratos de variación genómica relacionada con el riesgo de enfermedad 3,4. Por lo tanto, la necesidad de comprender la dinámica de la función potenciadora es fundamental para el progreso en las aplicaciones de la ciencia traslacional y básica dentro de la genómica. Las predicciones in silico de la actividad potenciadora pueden servir como excelentes recursos para generar hipótesis en cuanto a la capacidad potenciadora 5,6. Tal actividad potenciadora predicha puede requerir validación e interrogación adicionales para una comprensión completa de la actividad funcional. Los ensayos de Enhancer Reporter han demostrado ser valiosos para este propósito en una variedad de sistemas, desde células hasta animales 7,8,9. Con miras a extender estos estudios en un contexto transitorio de vivo flexible y rentable, este protocolo describe el uso de métodos in vivo basados en AAV para probar secuencias potenciadoras putativas por su capacidad para impulsar la expresión de un gen reportero ectópico en el cerebro postnatal del ratón. Esta familia de métodos tiene utilidad para interrogar secuencias candidatas individuales o cribado paralelo de bibliotecas y es relevante para la investigación básica y traslacional.

Este método combina en un solo plásmido una secuencia de ADN candidato potenciador putativo con un gen reportero (aquí EGFP), bajo el control de un promotor mínimo que por sí solo no impulsa una expresión significativa. El plásmido se empaqueta en AAV recombinante (rAAV) y se inyecta en un modelo animal. Si bien la aplicación aquí es al cerebro, varios serotipos de rAAV permiten la infección a través de diferentes tipos de tejidos, de modo que este enfoque puede extenderse a otros sistemas10. Después de un período de tiempo, el cerebro puede ser recolectado y ensayado para la expresión del gen reportero. La expresión fuerte, en comparación con los controles, indica que la secuencia candidata probada fue capaz de “mejorar” la expresión del gen (Figura 1). Este diseño simple ofrece un enfoque fácil y claro para probar una secuencia de actividad potenciadora in vivo en el cerebro.

Además de probar la capacidad potenciadora de una secuencia, este método se puede combinar con técnicas para determinar la actividad potenciadora del tipo celular. En los enfoques basados en secuencias para determinar la actividad potenciadora diferencial, la clasificación de células en marcadores específicos de tipo celular antes de la secuenciación de ADN y ARN puede permitir a los investigadores determinar si diferentes tipos de células muestran actividad potenciadora diferencial, como se describió en Gisselbrecht et al.11. En los enfoques basados en imágenes, el etiquetado conjunto de imágenes con marcadores específicos del tipo de célula permite examinar si las células que exhiben fluorescencia impulsada por potenciadores también muestran marcadores de tipo celular de interés 12,13,14,15,16. Los ensayos de reportero de potenciadores permiten realizar pruebas directas de la variación alélica asociada al riesgo en los potenciadores para detectar efectos sobre la capacidad del potenciador. La gran mayoría de los loci de riesgo identificados en los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se encuentran en regiones no codificantes del genoma17. Los estudios de anotación funcional de estos loci de riesgo indican que una gran parte probablemente actúa como potenciadores18,19,20. El despliegue de MPRA in vivo puede permitir probar estas variantes asociadas al riesgo para la actividad potenciadora en el cerebro12,21. Finalmente, la entrega y la recolección en diferentes puntos de tiempo pueden ofrecer información sobre las etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo.

Los diseños de plásmidos potenciadores-reporteros son diversos y se pueden personalizar para adaptarse a los objetivos experimentales. Hay varias opciones para promotores mínimos que se han utilizado en la investigación de potenciadores, como el promotor mínimo de β-globinahumana 22 y el promotor mínimo de ratón Hsp6823. Se sabe que estos promotores impulsan bajos niveles de expresión a menos que se combinen con un elemento potenciador para activarlos. En contraste, los elementos promotores constitutivos impulsan la expresión fuerte del transgén, útil para el control positivo o para probar la función potenciadora en un contexto de expresión robusta. Las opciones comunes para los promotores constitutivos incluyen CAG, un promotor híbrido derivado del promotor de β actina de pollo y el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus24, o EF1α25 humano. Dado que se sabe que los potenciadores funcionan bidireccionalmente26, la orientación y la ubicación del potenciador en relación con el promotor mínimo son flexibles (Figura 2A). Los ensayos tradicionales de potenciador-reportero colocan el potenciador aguas arriba del promotor y, en las entregas de la biblioteca, incluyen una secuencia de código de barras aguas abajo del gen reportero para asociar las lecturas de secuenciación con el potenciador probado27. Sin embargo, los potenciadores también se pueden colocar en el marco de lectura abierto del gen reportero y servir como su propia secuencia de código de barras, como se hace en STARR-seq28. El protocolo descrito aquí utiliza el diseño del ensayo STARR-seq, colocando la secuencia del potenciador candidato en el UTR 3′ del gen reportero. Si bien la orientación STARR-seq ofrece el beneficio de una clonación más simplificada, es menos conocida que el enfoque convencional y puede inducir una estabilidad variable del ARN entre las construcciones. Los métodos descritos pueden adaptarse fácilmente a la orientación STARR-seq o convencional con alteraciones menores en el proceso de clonación que se han descrito en otra parte27,29.

Se pueden emplear diferentes métodos de administración de AAV para personalizar aún más esta técnica para que se ajuste a los objetivos experimentales (Figura 2B). Las inyecciones intracraneales directas, descritas más adelante en este protocolo, entregan una alta concentración de virus directamente al cerebro30. Esto proporciona una alta eficiencia de transducción centrada en el sitio de inyección, lo que la convierte en una excelente técnica para experimentos que buscan maximizar la densidad de las células transducidas sobre un área de tejido. La inyección estereotáctica puede ayudar a estandarizar el sitio de inyección en animales para la transducción localizada reproducible. Las inyecciones intracraneales son más sencillas en animales postnatales tempranos. Como técnica alternativa, las inyecciones sistémicas pueden entregar transgenes utilizando AAVs con serotipos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica31. Las inyecciones en las venas de la cola permiten que el virus circule por todo el cuerpo, lo que permite la administración generalizada a través de muchos tejidos10. Las inyecciones retroorbitarias son otra técnica de inyección sistémica que libera el virus detrás del ojo en el seno retroorbitario32. Esto ofrece una ruta más directa para el AAV desde el sistema venoso hasta el cerebro, resultando en una mayor concentración de células transducidas en el cerebro que las inyecciones en vasos sanguíneos más periféricos33.

Otro aspecto flexible de esta técnica es el método de lectura. En términos generales, las opciones pueden describirse como basadas en reporteros o en secuenciación (Figura 2C). La incorporación de un reportero fluorescente como GFP en el marco de lectura abierto del constructo da como resultado la expresión de la proteína fluorescente en cualquier célula transducida donde el potenciador candidato impulsó la expresión. Las técnicas de etiquetado e imagen, como la inmunohistoquímica, permiten la amplificación de la señal. Las técnicas de lectura basadas en la secuenciación implican la identificación de secuencias de la construcción entregada en ARN recolectado del tejido. Al cuantificar la cantidad de ADN viral que se entregó inicialmente, la comparación del ARN expresado versus el ADN entregado se puede utilizar para determinar el grado en que una secuencia potenciadora probada fue capaz de impulsar una mayor expresión del transgén, por ejemplo, en el contexto de un ensayo de reportero masivamente paralelo (MPRA). Los MPRA ofrecen una poderosa expansión de estas técnicas para probar hasta miles de potenciadores candidatos para la actividad simultáneamente y se han descrito ampliamente en la investigación genómica 12,27,34,35,36. Se logra una mayor detección de rendimiento mediante la ejecución de pasos de clonación, empaquetado, entrega y secuenciación para los potenciadores candidatos en lotes en lugar de individualmente.

La selección del potenciador candidato ofrece otra oportunidad para la flexibilidad (Figura 2D). Por ejemplo, este ensayo se puede utilizar para identificar potenciadores de un gen específico, para determinar la función de las regiones de interés del ADN no codificante, o para determinar tipos específicos de células o etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo, todo lo cual sirve para objetivos tanto en la ciencia básica como en la investigación de enfermedades. En general, la selección del potenciador candidato está impulsada por predicciones in silico de la actividad del potenciador. Comúnmente, las predicciones in silico incluyen ChIP-seq para modificaciones de histonas que indican potenciadores probables, como H3K27ac37 y mapeo de accesibilidad de cromatina38. Finalmente, un área de investigación creciente es el cribado basado en funciones de elementos potenciadores diseñados sintéticamente, lo que permite estudios de cómo la secuencia de potenciadores dirige la función39 y el diseño de potenciadores con propiedades específicas40.

Protocol

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis (Protocolo #22339) y el Comité Institucional de Bioseguridad de UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo ha sido probado en ratones C57BL/6J de ambos sexos en el día postnatal 0-1. 1. Clone la secuencia candidata potenciadora en el plásmido vectorial AAV. NOTA: Se dan los protocolos representativos, pero la estrategia de clonación tiene un alto grado …

Representative Results

Usando estos métodos, se probó una secuencia de 915 pb en el tercer intrón asociado al riesgo psiquiátrico del gen CACNA1C19,49,50 para determinar la actividad potenciadora en el cerebro postnatal del ratón. Esta secuencia fue descubierta en un MPRA de 345 secuencias candidatas potenciadoras centradas en SNPs de riesgo psiquiátrico y neurológico12 y los experimentos de caracterización se …

Discussion

Este protocolo describe un método basado en rAAV para el despliegue de transgenes impulsados por potenciadores en el cerebro postnatal del ratón. En este protocolo generalizado, un potenciador candidato, un promotor mínimo, un gen reportero y una secuencia de código de barras opcional se clonan en una columna vertebral de plásmidos AAV. Estos experimentos se pueden hacer con una sola secuencia potenciadora candidata o con muchas secuencias en paralelo. El plásmido se empaqueta en un rAAV y se administra al cerebro …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La secuenciación se realizó en el UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos al laboratorio de Lin Tian en UC Davis por la capacitación en el empaque de rAAV y por regalarnos generosamente plásmidos de AAV helper y rep / cap. Este trabajo fue apoyado por NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image