JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров In Vivo в мозге мыши

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.

Abstract

Энхансеры являются связывающими платформами для разнообразного набора факторов транскрипции, которые управляют специфическими паттернами экспрессии ткане- и клеточных генов. Многочисленные средства оценки некодирующей ДНК и различных состояний хроматина оказались полезными для прогнозирования наличия энхансерных последовательностей в геноме, но проверка активности этих последовательностей и поиск органов и стадий развития, в которых они активны, является трудоемким процессом. Недавние достижения в области переносчиков аденоассоциированного вируса (AAV) позволили широко доставить трансгены в ткани мыши, что позволило проводить тестирование усилителей in vivo без необходимости трансгенного животного. Этот протокол показывает, как репортерная конструкция, которая выражает EGFP под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значительным выражением, может быть использована для изучения паттернов активности последовательностей-усилителей кандидатов в мозге мыши. Упакованную AAV конструкцию репортера доставляют в мозг мыши и инкубируют в течение 1-4 недель, после чего животное приносят в жертву, а участки мозга наблюдают под микроскопом. EGFP появляется в клетках, в которых тестируемого энхансера достаточно для инициирования экспрессии генов, точно определяя местоположение и стадию развития, на которой энхансер активен в мозге. Стандартные методы клонирования, недорогая упаковка AAV и расширение серотипов AAV и методов доставки in vivo и стандартного считывания изображений делают этот подход доступным для изучения того, как экспрессия генов регулируется в мозге.

Introduction

Энхансеры представляют собой геномные цис-регуляторные элементы, которые служат сайтами связывания транскрипционного фактора и могут стимулировать экспрессию гена-мишени пространственно-временнымспецифическим способом 1,2. Они дифференциально активны в различных типах клеток, тканях и стадиях развития и могут быть субстратами геномной вариации, связанной с риском заболевания 3,4. Таким образом, необходимость понимания динамики функции энхансера имеет решающее значение для прогресса как в трансляционных, так и в фундаментальных научных приложениях в геномике. In silico предсказания активности энхансера могут служить отличными ресурсами для генерации гипотез относительно способности усилителя 5,6. Такая предсказанная активность усилителя может потребовать дополнительной проверки и опроса для полного понимания функциональной активности. Анализы репортера Enhancer оказались ценными для этой цели в различных системах, от клеток до животных 7,8,9. Для расширения этих исследований в гибком и экономически эффективном переходном контексте in vivo этот протокол описывает использование методов на основе in vivo AAV для проверки предполагаемых последовательностей энхансеров на их способность управлять экспрессией эктопического репортерного гена в постнатальном мозге мыши. Это семейство методов полезно для опроса последовательностей с одним кандидатом или параллельного библиотечного скрининга и актуально для фундаментальных и трансляционных исследований.

Этот метод объединяет в одной плазмиде предполагаемую последовательность ДНК-кандидата энхансера с репортерным геном (здесь EGFP), под контролем минимального промотора, который сам по себе не управляет значимой экспрессией. Плазмида упаковывается в рекомбинантный AAV (rAAV) и вводится в животную модель. В то время как применение здесь относится к мозгу, различные серотипы rAAV позволяют инфекцию через различные типы тканей, так что этот подход может быть распространен на другие системы10. Через некоторое время мозг может быть собран и проанализирован для экспрессии репортерного гена. Сильная экспрессия, по сравнению с контрольной группой, указывает на то, что тестируемая последовательность-кандидат смогла «усилить» экспрессию гена (рисунок 1). Эта простая конструкция предлагает легкий и понятный подход к тестированию последовательности активности энхансеров in vivo в мозге.

В дополнение к тестированию на энхансерную способность последовательности, этот метод может быть объединен с методами определения активности энхансера клеточного типа. В последовательных подходах к определению дифференциальной активности энхансеров сортировка клеток по маркерам клеточного типа до секвенирования ДНК и РНК может позволить исследователям определить, проявляют ли различные типы клеток дифференциальную активность энхансеров, как было описано в Gisselbrecht et al.11. В подходах, основанных на визуализации, совместная маркировка изображений с маркерами, специфичными для клеточного типа, позволяет изучить, отображают ли клетки, проявляющие флуоресценцию, управляемую энхансером, также маркеры клеточного типа, представляющие интерес 12,13,14,15,16. Репортерные анализы энхансеров позволяют напрямую тестировать связанные с риском аллельные вариации в энхансерах на предмет воздействия на способность усилителя. Подавляющее большинство локусов риска, идентифицированных в общегеномных ассоциативных исследованиях (GWAS), лежат в некодирующих областях генома17. Исследования функциональных аннотаций этих локусов риска показывают, что большая часть, вероятно, действует как энхансеры 18,19,20. Развертывание MPRA in vivo может позволить протестировать эти связанные с риском варианты активности энхансеров в мозге 12,21. Наконец, доставка и сбор в разные моменты времени могут дать представление о стадиях развития, на которых активен энхансер.

Конструкции плазмид Энхансер-Репортер разнообразны и могут быть настроены в соответствии с экспериментальными целями. Существует несколько вариантов минимальных промоторов, которые использовались в исследованиях энхансеров, таких как минимальный промотор22 β-глобина человека и минимальный промотор23 мышиного Hsp68. Известно, что эти промоторы приводят к низким уровням экспрессии, если не сочетаются с энхансерным элементом для их активации. Напротив, конститутивные промоторные элементы стимулируют сильную экспрессию трансгена, что полезно для положительного контроля или для тестирования на функцию энхансера на фоне надежной экспрессии. Общий выбор конститутивных промоторов включает CAG, гибридный промотор, полученный из промотора куриного β-актина и цитомегаловируса немедленно-раннего энхансера24 или человеческого EF1α25. Поскольку известно, что энхансеры работают двунаправленно26, ориентация и расположение энхансера относительно минимального промотора являются гибкими (рисунок 2А). Традиционные энхансерно-репортерные анализы помещают энхансер выше по течению промотора и, в библиотечных поставках, включают последовательность штрих-кода ниже по течению от гена репортера, чтобы связать показания секвенирования с тестируемым энхансером27. Тем не менее, энхансеры также могут быть помещены в открытую рамку чтения репортерного гена и служить их собственной последовательностью штрих-кода, как это сделано в STARR-seq28. Протокол, описанный здесь, использует конструкцию анализа STARR-seq, помещая последовательность энхансера-кандидата в 3’UTR репортерного гена. Хотя ориентация STARR-seq предлагает преимущество более упорядоченного клонирования, она менее понятна, чем традиционный подход, и может вызывать переменную стабильность РНК между конструкциями. Описанные способы могут быть легко адаптированы либо к STARR-seq, либо к обычной ориентации с незначительными изменениями в процессе клонирования, которые были описаны в другом месте27,29.

Различные методы доставки AAV могут быть использованы для дальнейшей настройки этого метода в соответствии с экспериментальными целями (рисунок 2B). Прямые внутричерепные инъекции, описанные далее в этом протоколе, доставляют высокую концентрацию вируса непосредственно в мозг30. Это дает высокую эффективность трансдукции, сосредоточенной в месте инъекции, что делает ее отличной техникой для экспериментов, направленных на максимизацию плотности трансдуцированных клеток на участке ткани. Стереотаксическая инъекция может помочь стандартизировать место инъекции у животных для воспроизводимой локализованной трансдукции. Внутричерепные инъекции наиболее просты у ранних послеродовых животных. В качестве альтернативного метода системные инъекции могут доставлять трансгены с использованием AAV с серотипами, способными пересекать гематоэнцефалический барьер31. Инъекции в хвостовые вены позволяют вирусу циркулировать по всему телу, обеспечивая генерализованную доставку через многие ткани10. Ретроорбитальные инъекции являются еще одним методом системной инъекции, который доставляет вирус за глаз в ретро-орбитальный синус32. Это обеспечивает более прямой путь для AAV из венозной системы в мозг, что приводит к более высокой концентрации трансдуцированных клеток в мозге, чем инъекции в более периферические кровеносные сосуды33.

Другим гибким аспектом этой техники является метод считывания. В широком смысле варианты можно описать как основанные на репортерах или последовательности (рисунок 2C). Включение флуоресцентного репортера, такого как GFP, в открытую рамку считывания конструкции приводит к экспрессии флуоресцентного белка в любых трансдуцированных клетках, где энхансер-кандидат управлял экспрессией. Методы маркировки и визуализации, такие как иммуногистохимия, позволяют усиливать сигнал. Методы считывания на основе секвенирования включают идентификацию последовательностей из доставленной конструкции в РНК, собранной из ткани. Количественно оценивая количество вирусной ДНК, которая была первоначально доставлена, сравнение экспрессированной РНК и доставленной ДНК может быть использовано для определения степени, в которой протестированная последовательность энхансеров была способна стимулировать повышенную экспрессию трансгена, например, в контексте массово параллельного репортерного анализа (MPRA). MPRAs предлагают мощное расширение этих методов для одновременного тестирования до тысяч потенциальных энхансеров активности и были подробно описаны в исследованиях геномики 12,27,34,35,36. Более высокая пропускная способность скрининга достигается за счет выполнения этапов клонирования, упаковки, доставки и секвенирования для потенциальных усилителей в партии, а не по отдельности.

Выбор усилителя кандидата предоставляет еще одну возможность для гибкости (рисунок 2D). Например, этот анализ может быть использован для идентификации энхансеров определенного гена, для определения функции интересующих некодирующих областей ДНК или для определения конкретных типов клеток или стадий развития, во время которых активен энхансер – все это служит целям как в фундаментальной науке, так и в исследованиях заболеваний. Как правило, выбор энхансера-кандидата обусловлен in silico предсказаниями активности энхансера. Как правило, прогнозы in silico включают ChIP-seq для модификаций гистонов, которые указывают на вероятные энхансеры, такие как H3K27ac37 и картирование доступности хроматина38. Наконец, растущей областью исследований является функциональный скрининг синтетически разработанных энхансерных элементов, позволяющий изучать, как последовательность энхансеров направляет функцию39 , и дизайн усилителей с конкретными свойствами40.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Дэвисе (Протокол No 22339) и Институциональным комитетом по биобезопасности Калифорнийского университета в Дэвисе (BUA-R1903). Этот протокол был протестирован на мышах C57BL/6…

Representative Results

Используя эти методы, последовательность 915 bp в связанном с психиатрическим риском третьем интроне гена CACNA1C 19,49,50 была протестирована на энхансерную активность в постнатальном мозге мыши. Эта последовательность была обнаружена в…

Discussion

Этот протокол описывает основанный на rAAV метод развертывания трансгенов, управляемых энхансерами, в постнатальном мозге мыши. В этом обобщенном протоколе энхансер-кандидат, минимальный промотор, репортерный ген и необязательная последовательность штрих-кода клонируются в плазмидну?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Секвенирование проводилось в UC Davis DNA Technologies Core. Мы благодарим лабораторию Лин Тяня в Калифорнийском университете в Дэвисе за обучение упаковке rAAV и щедро дарим нам помощника AAV и плазмиды rep /cap. Эта работа была поддержана NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain
check_url/fr/62650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image