JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Neurosciences

AAV-implementering af forstærkerbaserede ekspressionskonstruktioner in vivo i musehjerne

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Denne protokol beskriver et nyt rAAV-baseret forbigående forstærker-reporter-assay. Dette assay kan bruges til at inducere forstærkerdrevet udtryk in vivo i musehjernen.

Abstract

Enhancers er bindende platforme for en bred vifte af transkriptionsfaktorer, der driver specifikke ekspressionsmønstre af vævs- og celletypespecifikke gener. Flere midler til vurdering af ikke-kodende DNA og forskellige kromatintilstande har vist sig nyttige til at forudsige tilstedeværelsen af forstærkersekvenser i genomet, men validering af aktiviteten af disse sekvenser og at finde de organer og udviklingsstadier, de er aktive i, er en arbejdskrævende proces. De seneste fremskridt inden for adeno-associerede virusvektorer (AAV) har muliggjort udbredt levering af transgener til musevæv, hvilket muliggør in vivo-forstærkertest uden at kræve et transgent dyr. Denne protokol viser, hvordan en reporterkonstruktion, der udtrykker EGFP under kontrol af en minimal promotor, som ikke driver signifikant udtryk alene, kan bruges til at studere aktivitetsmønstrene for kandidatforstærkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruktion leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uger, hvorefter dyret ofres, og hjerneafsnit observeres under et mikroskop. EGFP forekommer i celler, hvor den testede forstærker er tilstrækkelig til at initiere genekspression, der lokaliserer placeringen og udviklingsstadiet, hvor forstærkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, billig AAV-emballage og udvidelse af AAV-serotyper og metoder til in vivo-levering og standardbilleddannelsesaflæsning gør dette til en tilgængelig tilgang til undersøgelse af, hvordan genekspression reguleres i hjernen.

Introduction

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer, der tjener som transkriptionsfaktorbindingssteder og kan drive ekspressionen af et målgen på en spatiotemporalt specifik måde 1,2. De er forskelligt aktive i forskellige celletyper, væv og udviklingsstadier og kan være substrater for sygdomsrisikorelateret genomisk variation 3,4. Behovet for at forstå dynamikken i forstærkerfunktionen er således afgørende for fremskridt inden for både translationelle og grundlæggende videnskabelige applikationer inden for genomik. In silico forudsigelser af forstærkeraktivitet kan tjene som fremragende ressourcer til at generere hypoteser om forstærkerkapacitet 5,6. En sådan forudsagt forstærkeraktivitet kan kræve yderligere validering og forhør for en fuld forståelse af den funktionelle aktivitet. Enhancer reporter-assays har vist sig værdifulde til dette formål på tværs af en række systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mod at udvide disse undersøgelser i en fleksibel og omkostningseffektiv forbigående in vivo-sammenhæng beskriver denne protokol brugen af in vivo AAV-baserede metoder til at teste formodede forstærkersekvenser for deres evne til at drive ekspressionen af et ektopisk reportergen i den postnatale musehjerne. Denne familie af metoder har nytte til at forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallel biblioteksscreening og er relevant for grundlæggende og translationel forskning.

Denne metode kombinerer i et enkelt plasmid en formodet forstærkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP) under kontrol af en minimal promotor, der alene ikke driver signifikant ekspression. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiceres i en dyremodel. Mens applikationen her er til hjernen, muliggør forskellige rAAV-serotyper infektion på tværs af forskellige vævstyper, så denne tilgang kan udvides til andre systemer10. Efter en periode kan hjernen indsamles og analyseres til ekspression af reportergenet. Stærk ekspression sammenlignet med kontroller indikerer, at den testede kandidatsekvens var i stand til at “forbedre” ekspressionen af genet (figur 1). Dette enkle design tilbyder en nem og klar tilgang til at teste en sekvens for forstærkeraktivitet in vivo i hjernen.

Ud over at teste for forstærkerens evne til en sekvens kan denne metode kombineres med teknikker til bestemmelse af celletypeforstærkeraktivitet. I sekvensbaserede tilgange til bestemmelse af differentiel forstærkeraktivitet kan sortering af celler på celletypespecifikke markører forud for DNA- og RNA-sekventering give forskere mulighed for at bestemme, om forskellige celletyper viser differentiel forstærkeraktivitet, som det blev beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I billeddannelsesbaserede tilgange tillader co-mærkning af billeder med celletypespecifikke markører undersøgelse af, om celler, der udviser forstærkerdrevet fluorescens, også viser celletypemarkører af interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporter-assays muliggør direkte test af risikoassocieret allelvariation i forstærkere for effekter på forstærkerens kapacitet. Langt størstedelen af de risikoområder, der er identificeret i genom-dækkende associeringsundersøgelser (GWAS), ligger i ikke-kodende regioner i genomet17. Funktionelle annotationsundersøgelser af disse risikosteder indikerer, at en stor del sandsynligvis fungerer som forstærkere18,19,20. MPRA-implementering in vivo kan muliggøre test af disse risikoassocierede varianter for forstærkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og afhentning på forskellige tidspunkter give indsigt i de udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv.

Enhancer-reporter plasmid design er forskellige og kan tilpasses til at passe til eksperimentelle mål. Der er flere muligheder for minimale promotorer, der er blevet brugt i forstærkerforskning, såsom den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotorer er kendt for at drive lave udtryksniveauer, medmindre de kombineres med et forstærkerelement for at aktivere dem. I modsætning hertil driver konstitutive promotorelementer stærk ekspression af transgenet, nyttigt til positiv kontrol eller til at teste for forstærkerfunktion på baggrund af robust ekspression. Almindelige valg for konstitutive promotorer omfatter CAG, en hybridpromotor afledt af kylling β-actin-promotoren og cytomegalovirus øjeblikkelig-tidlig forstærker24 eller human EF1α25. Da forstærkere vides at arbejde tovejs26, er forstærkerens orientering og placering i forhold til den minimale promotor fleksibel (figur 2A). Traditionelle forstærker-reporter-assays placerer forstærkeren opstrøms for promotoren og inkluderer i biblioteksleverancer en stregkodesekvens nedstrøms for reportergenet for at forbinde sekventeringslæsninger med den testede forstærker27. Forstærkere kan dog også placeres i den åbne læseramme af reportergenet og fungere som deres egen stregkodesekvens, som det gøres i STARR-seq28. Protokollen, der er beskrevet her, anvender STARR-seq-analysedesignet og placerer kandidatforstærkersekvensen i 3 ‘UTR af reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen giver fordelen ved mere strømlinet kloning, er den mindre godt forstået end den konventionelle tilgang og kan inducere variabel RNA-stabilitet mellem konstruktioner. De beskrevne metoder kan let tilpasses enten STARR-seq eller konventionel orientering med mindre ændringer i kloningsprocessen, der er beskrevet andetsteds27,29.

Forskellige metoder til AAV-levering kan anvendes til yderligere at tilpasse denne teknik, så den passer til eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injektioner, beskrevet yderligere i denne protokol, leverer en høj koncentration af virus direkte til hjernen30. Dette giver en høj transduktionseffektivitet centreret på injektionsstedet, hvilket gør dette til en fremragende teknik til eksperimenter, der søger at maksimere tætheden af transducerede celler over et vævsområde. Stereotaktisk injektion kan hjælpe med at standardisere injektionsstedet på tværs af dyr til reproducerbar lokaliseret transduktion. Intrakranielle injektioner er mest ligetil hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknik kan systemiske injektioner levere transgener ved hjælp af AAV’er med serotyper, der er i stand til at krydse blod-hjerne-barrieren31. Hale-vene injektioner tillader virus at cirkulere i hele kroppen, hvilket muliggør generaliseret levering på tværs af mange væv10. Retro-orbitale injektioner er en anden systemisk injektionsteknik, der leverer virussen bag øjet ind i retro-orbital sinus32. Dette giver en mere direkte rute for AAV fra det venøse system til hjernen, hvilket resulterer i en højere koncentration af transducerede celler i hjernen end injektioner i mere perifere blodkar33.

Et andet fleksibelt aspekt af denne teknik er metoden til udlæsning. Generelt kan optioner beskrives som reporterbaserede eller sekventeringsbaserede (figur 2C). Inkorporering af en fluorescerende reporter som GFP i konstruktionens åbne læseramme resulterer i ekspression af det fluorescerende protein i alle transducerede celler, hvor kandidatforstærkeren drev udtryk. Mærkning og billeddannelsesteknikker såsom immunhistokemi muliggør signalforstærkning. Sekventering baseret udlæsning teknikker involverer identifikation af sekvenser fra den leverede konstruktion i RNA indsamlet fra vævet. Ved at kvantificere mængden af viralt DNA, der oprindeligt blev leveret, kan sammenligningen af udtrykt RNA versus leveret DNA bruges til at bestemme, i hvilken grad en testet forstærkersekvens var i stand til at drive øget ekspression af transgenet, for eksempel i forbindelse med et massivt parallelt reporterassay (MPRA). MPRA’er tilbyder en kraftig udvidelse af disse teknikker til at teste op til tusindvis af kandidatforstærkere for aktivitet samtidigt og er blevet beskrevet udførligt i genomforskning 12,27,34,35,36. Højere gennemløbsscreening opnås ved at udføre klonings-, emballerings-, leverings- og sekventeringstrin for kandidatforstærkere i batch snarere end individuelt.

Valg af kandidatforstærker giver endnu en mulighed for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan dette assay bruges til at identificere forstærkere af et specifikt gen, til at fastslå funktionen af ikke-kodende DNA-regioner af interesse eller til at bestemme specifikke celletyper eller udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv – som alle tjener mål både inden for grundvidenskab og sygdomsforskning. Generelt er valg af kandidatforstærker drevet af in silico-forudsigelser af forstærkeraktivitet. Almindeligvis inkluderer in silico-forudsigelser ChIP-seq for histonmodifikationer, der indikerer sandsynlige forstærkere, såsom H3K27ac37 og chromatintilgængelighedskortlægning38. Endelig er et voksende forskningsområde den funktionsbaserede screening af syntetisk designede forstærkerelementer, der muliggør undersøgelser af, hvordan forstærkersekvensen styrer funktion39 og design af forstærkere med specifikke egenskaber40.

Protocol

Denne protokol er godkendt af UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokol #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokol er blevet testet på C57BL/6J mus af begge køn på postnatal dag 0-1. 1. Klon forstærkerkandidatsekvensen ind i AAV-vektorplasmidet. BEMÆRK: De repræsentative protokoller er angivet, men kloningsstrategien har en høj grad af fleksibilitet. Vælg eller design en r…

Representative Results

Ved hjælp af disse metoder blev en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassocierede tredje intron af genet CACNA1C19,49,50 testet for forstærkeraktivitet i den postnatale musehjerne. Denne sekvens blev opdaget i en MPRA af 345 kandidatforstærkersekvenser centreret om psykiatriske og neurologiske risiko SNP’er12, og karakteriseringseksperimenter beskrives her som et generelt eksempel. C57BL/…

Discussion

Denne protokol beskriver en rAAV-baseret metode til implementering af forstærkerdrevne transgener i den postnatale musehjerne. I denne generaliserede protokol klones en kandidatforstærker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri stregkodesekvens til en AAV-plasmidrygrad. Disse eksperimenter kan udføres med en enkelt kandidatforstærkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plamidlet pakkes i en rAAV og leveres til den postnatale musehjerne. Efter en periode for at muliggøre virustransduktion indsamles…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sekventering blev udført på UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet for Lin Tian på UC Davis for træning i rAAV-emballage og generøst forærende os AAV-hjælper og rep / cap-plasmider. Dette arbejde blev støttet af NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain
check_url/fr/62650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image