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Neurosciences

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

このプロトコルは、新規rAAVベースの一過性エンハンサー-レポーターアッセイを記載しています。このアッセイは、マウス脳において in vivo でエンハンサー駆動発現を誘導するために使用することができる。

Abstract

エンハンサーは、組織および細胞型特異的遺伝子の特異的発現パターンを駆動する多様な転写因子の結合プラットフォームです。ノンコーディングDNAとさまざまなクロマチン状態を評価する複数の手段は、ゲノム中のエンハンサー配列の存在を予測するのに有用であることが証明されていますが、これらの配列の活性を検証し、それらが活性である器官と発生段階を見つけることは労働集約的なプロセスです。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの最近の進歩により、マウス組織への導入遺伝子の広範な送達が可能になり、トランスジェニック動物を必要とせずに in vivo エンハンサー試験が可能になりました。このプロトコルは、それ自体では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下でEGFPを発現するレポーターコンストラクトを使用して、マウス脳内の候補エンハンサー配列の活性パターンを研究する方法を示しています。AAVパッケージレポーターコンストラクトをマウスの脳に送達し、1〜4週間インキュベートした後、動物を屠殺し、脳切片を顕微鏡で観察します。EGFPは、試験されたエンハンサーが遺伝子発現を開始するのに十分である細胞に現れ、エンハンサーが脳内で活性である位置および発生段階を特定する。標準的なクローニング法、低コストのAAVパッケージング、および拡張AAV血清型と in vivo 送達および標準的なイメージング読み出しのための方法により、これは脳内で遺伝子発現がどのように調節されるかを研究するためのアクセス可能なアプローチになります。

Introduction

エンハンサーは、転写因子結合部位として機能するゲノムシス調節要素であり、時空間的に特異的な方法で標的遺伝子の発現を駆動することができます1,2。それらは、異なる細胞型、組織、および発生段階で差動的に活性であり、疾患リスク関連のゲノム変異の基質となり得る3,4。したがって、エンハンサー機能のダイナミクスを理解する必要性は、ゲノミクス内のトランスレーショナルサイエンスアプリケーションと基礎科学アプリケーションの両方で進歩するために重要です。インシリコエンハンサー活性の予測は、エンハンサー能力に関する仮説を生成するための優れたリソースとして役立ち得る5、6。そのような予測されたエンハンサー活性は、機能的活性を完全に理解するために追加の検証および尋問を必要とし得る。エンハンサーレポーターアッセイは、細胞から動物まで、さまざまなシステムでこの目的のために価値があることが証明されています7、8、9。柔軟で費用対効果の高い一過性のin vivoコンテキストでこれらの研究を拡張するために、このプロトコルは、生後マウス脳における異所性レポーター遺伝子の発現を促進する能力について推定エンハンサー配列をテストするためのin vivoAAVベースの方法の使用について説明しています。この一連の方法は、単一の候補配列または並行ライブラリスクリーニングを調べるための有用性があり、基礎研究およびトランスレーショナル研究に関連しています。

この方法は、レポーター遺伝子(ここではEGFP)を有する推定エンハンサー候補DNA配列を単一のプラスミド中で組み合わせ、単独では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下にある。プラスミドは組換えAAV(rAAV)にパッケージされ、動物モデルに注入されます。ここでの応用は脳へのものであるが、様々なrAAV血清型は、異なる組織型にわたる感染を可能にするので、このアプローチを他のシステムに拡張することができる10。一定期間後、脳を収集し、レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることができる。強い発現は、対照と比較して、試験された候補配列が遺伝子の発現を「増強」することができたことを示す(図1)。このシンプルなデザインは、脳内のin vivo でのエンハンサー活性のシーケンスをテストするための簡単で明確なアプローチを提供します。

配列のエンハンサー能力の試験に加えて、この方法は、細胞型エンハンサー活性を決定するための技術と組み合わせることができる。差次的エンハンサー活性を決定するための配列ベースのアプローチでは、DNAおよびRNAシーケンシングの前に細胞型特異的マーカーで細胞を選別することで、Gisselbrechtら11に記載されているように、異なる細胞型が異なるエンハンサー活性を示すかどうかを研究者が判断できます。イメージングベースのアプローチでは、細胞型特異的マーカーと画像を共標識することで、エンハンサー駆動蛍光を示す細胞が目的の細胞型マーカーも表示するかどうかを調べることができます12、13、14、15、16。エンハンサーレポーターアッセイは、エンハンサー能力への影響について、エンハンサーのリスク関連対立遺伝子変異を直接試験することができます。ゲノムワイド関連研究(GWAS)で同定されたリスク遺伝子座の大部分は、ゲノム17の非コード領域にあります。これらのリスク遺伝子座の機能的アノテーション研究は、大部分がエンハンサーとして作用する可能性が高いことを示している18、19、20。インビボでのMPRA展開は、脳におけるエンハンサー活性についてのこれらのリスク関連変異体の試験を可能にすることができる12、21。最後に、異なる時点での送達および収集は、エンハンサーが活性である発達段階への洞察を提供することができる。

エンハンサーレポータープラスミドの設計は多様であり、実験目標に合わせてカスタマイズできます。エンハンサー研究で使用されてきた最小プロモーターには、ヒトβグロビン最小プロモーター22やマウスHsp68最小プロモーター23など、いくつかのオプションがあります。これらのプロモーターは、それらを活性化するためにエンハンサー要素と結合しない限り、低レベルの発現を駆動することが知られている。対照的に、構成的プロモーター要素は導入遺伝子の強い発現を駆動し、ポジティブコントロールまたは堅牢な発現の背景に対するエンハンサー機能の試験に有用である。構成的プロモーターの一般的な選択肢には、CAG、ニワトリβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス即時早期エンハンサー24に由来するハイブリッドプロモーター、またはヒトEF1α25が含まれる。エンハンサーは双方向に働くことが知られているので26、最小プロモーターに対するエンハンサーの向きおよび位置は柔軟である(図2A)。従来のエンハンサー−レポーターアッセイは、エンハンサーをプロモーターの上流に配置し、ライブラリー送達において、シーケンシングリードを試験されたエンハンサー27に関連付けるために、レポーター遺伝子の下流にバーコード配列を含む。しかしながら、エンハンサーは、STARR-seq28で行われているように、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームに配置し、それら自身のバーコード配列として機能することもできる。ここで説明するプロトコルは、STARR-seqアッセイデザインを利用し、候補エンハンサー配列をレポーター遺伝子の3′ UTRに配置します。STARR-seqオリエンテーションは、より合理化されたクローニングの利点を提供しますが、従来のアプローチよりもよく理解されておらず、コンストラクト間の可変RNA安定性を誘導する可能性があります。記載された方法は、他の箇所に記載されているクローニングプロセスにわずかな変更を加えるだけで、STARR−seqまたは従来のオリエンテーションのいずれかに容易に適合させることができる27、29。

AAV送達のさまざまな方法を採用して、実験目標に合わせてこの手法をさらにカスタマイズできます(図2B)。このプロトコールにさらに記載される直接頭蓋内注射は、高濃度のウイルスを脳30に直接送達する。これにより、注入部位を中心とした高い形質導入効率が得られ、組織の領域にわたって形質導入細胞の密度を最大化しようとする実験に最適な技術となります。定位注射は、再現性のある局所形質導入のために動物全体の注射部位を標準化するのに役立ちます。頭蓋内注射は、出生後初期の動物で最も簡単です。代替技術として、全身注射は、血液脳関門31を通過することができる血清型を有するAAVを用いて導入遺伝子を送達することができる。尾静脈注射は、ウイルスが体中を循環することを可能にし、多くの組織にわたる一般的な送達を可能にします10。眼窩後注射は、眼の後ろのウイルスを眼窩後洞32に送達する別の全身注射技術である。これは、静脈系から脳へのAAVのためのより直接的な経路を提供し、より多くの末梢血管への注射よりも脳内の形質導入細胞のより高い濃度をもたらす33。

この技術のもう一つの柔軟な側面は、読み出しの方法です。大まかに言えば、オプションはレポーターベースまたはシーケンシングベースとして説明できます(図2C)。GFPなどの蛍光レポーターをコンストラクトのオープンリーディングフレームに組み込むと、候補エンハンサーが発現を促進した形質導入細胞において蛍光タンパク質が発現します。免疫組織化学などの標識およびイメージング技術により、シグナル増幅が可能になります。シーケンシングベースの読み出し技術は、組織から収集されたRNA中の送達された構築物から配列を同定することを含む。最初に送達されたウイルスDNAの量を定量することにより、発現されたRNAと送達されたDNAの比較を使用して、例えば超並列レポーターアッセイ(MPRA)の状況において、試験されたエンハンサー配列が導入遺伝子の発現増加をどの程度促進できるかを決定することができる。MPRAは、これらの技術の強力な拡張を提供して、最大数千の候補エンハンサーの活性を同時にテストし、ゲノミクス研究で広く説明されています12、27、34、35、36。候補エンハンサーのクローニング、パッケージング、デリバリー、およびシーケンシングのステップを個別にではなくバッチで実行することにより、より高いスループットスクリーニングが実現されます。

候補エンハンサーの選択は、柔軟性のための別の機会を提供する(図2D)。例えば、このアッセイは、特定の遺伝子のエンハンサーの同定、目的の非コードDNA領域の機能の確認、またはエンハンサーが活性である特定の細胞型または発生段階の決定に使用できます。一般に、候補エンハンサーの選択は、エンハンサー活性の インシリコ 予測によって駆動される。一般に、 インシリコ 予測には、H3K27ac37 やクロマチンアクセシビリティマッピング38などのエンハンサーの可能性を示すヒストン修飾のChIP-seqが含まれます。最後に、成長している研究分野は、合成的に設計されたエンハンサー要素の機能ベースのスクリーニングであり、エンハンサー配列が機能39 をどのように指示するかの研究と、特定の特性を持つエンハンサーの設計を可能にします40。

Protocol

このプロトコルは、カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理および使用委員会(プロトコル#22339)およびカリフォルニア大学デービス校の施設バイオセーフティ委員会(BUA-R1903)によって承認されています。このプロトコルは、生後0〜1日目に男女のC57BL / 6Jマウスでテストされています。 1.エンハンサー候補配列をAAVベクタープラスミドにクローニングします。</str…

Representative Results

これらの方法を用いて、遺伝子CACNA1C19、49、50の精神医学的リスク関連第3イントロンにおける915bp配列を、出生後マウス脳におけるエンハンサー活性について試験した。この配列は、精神医学的および神経学的リスクSNPs12を中心とした345の候補エンハンサー配列のMPRAで発見され、ここでは一般的な?…

Discussion

このプロトコルは、出生後マウスの脳におけるエンハンサー駆動型導入遺伝子の展開のためのrAAVベースの方法を記載している。この一般化プロトコルでは、候補エンハンサー、最小プロモーター、レポーター遺伝子、および任意のバーコード配列がAAVプラスミド骨格にクローニングされます。これらの実験は、単一の候補エンハンサー配列を用いて、または多数の配列を並行して行うことが…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

シーケンシングは、UC Davis DNA Technologies Coreで実施されました。カリフォルニア大学デービス校のLin Tianの研究室には、rAAVパッケージングに関するトレーニングを提供し、AAVヘルパーとrep/capプラスミドを惜しみなく贈ってくれたことに感謝します。この作業はNIH/NIGMS R35GM119831の支援を受けた。

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
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