JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

Published: March 31, 2022
doi:
10.3791/62650
, ,
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior,University of California, Davis

Summary

Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.

Abstract

Arttırıcılar, doku ve hücre tipine özgü genlerin spesifik ekspresyon modellerini yönlendiren çeşitli transkripsiyon faktörleri dizisi için bağlayıcı platformlardır. Kodlamayan DNA’yı ve çeşitli kromatin durumlarını değerlendirmenin birçok yolunun, genomdaki arttırıcı dizilerin varlığını tahmin etmede yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak bu dizilerin aktivitesini doğrulamak ve aktif oldukları organları ve gelişim aşamalarını bulmak emek yoğun bir süreçtir. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerindeki son gelişmeler, transgenlerin fare dokularına yaygın olarak verilmesini sağlamış ve transgenik bir hayvana ihtiyaç duymadan in vivo arttırıcı testi mümkün kılmıştır. Bu protokol, EGFP’yi minimal bir promotörün kontrolü altında ifade eden, kendi başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen bir muhabir yapısının, fare beynindeki aday geliştirici dizilerinin aktivite kalıplarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. AAV paketlenmiş bir muhabir yapısı fare beynine teslim edilir ve 1-4 hafta boyunca inkübe edilir, daha sonra hayvan kurban edilir ve beyin bölümleri mikroskop altında gözlemlenir. EGFP, test edilen arttırıcının gen ekspresyonunu başlatmak için yeterli olduğu hücrelerde ortaya çıkar ve arttırıcının beyinde aktif olduğu yeri ve gelişim aşamasını belirler. Standart klonlama yöntemleri, düşük maliyetli AAV paketlemesi ve genişleyen AAV serotipleri ve in vivo dağıtım yöntemleri ve standart görüntüleme okuması, bunu gen ekspresyonunun beyinde nasıl düzenlendiğinin incelenmesi için erişilebilir bir yaklaşım haline getirmektedir.

Introduction

Arttırıcılar, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olarak hizmet eden genomik cis-düzenleyici elemanlardır ve bir hedef genin ekspresyonunu mekansal olarak zamansal olarak spesifik bir şekilde yönlendirebilir 1,2. Farklı hücre tiplerinde, dokularda ve gelişim aşamalarında farklı şekilde aktiftirler ve hastalık riskine bağlı genomik varyasyonun substratları olabilirler 3,4. Bu nedenle, arttırıcı fonksiyonun dinamiklerini anlama ihtiyacı, genomik içindeki hem translasyonel hem de temel bilim uygulamalarında ilerleme için kritik öneme sahiptir. Arttırıcı aktivitenin In silico tahminleri, arttırıcı yetenek 5,6 ile ilgili hipotezler üretmek için mükemmel kaynaklar olarak hizmet edebilir. Bu tür öngörülen arttırıcı aktivite, fonksiyonel aktivitenin tam olarak anlaşılması için ek doğrulama ve sorgulama gerektirebilir. Enhancer muhabir tahlilleri, hücrelerden hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde bu amaç için değerli olduğunu kanıtlamıştır 7,8,9. Bu çalışmaları esnek ve uygun maliyetli bir in vivo bağlamda genişletmeye yönelik olarak, bu protokol, doğum sonrası fare beyninde ektopik bir muhabir geninin ekspresyonunu sürme yetenekleri için varsayılan arttırıcı dizileri test etmek için in vivo AAV tabanlı yöntemlerin kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntem ailesi, tek aday dizileri veya paralel kütüphane taramasını sorgulamak için faydalıdır ve temel ve translasyonel araştırmalarla ilgilidir.

Bu yöntem, tek bir plazmidde, varsayılan bir arttırıcı aday DNA dizisini, tek başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen minimal bir promotörün kontrolü altında, bir muhabir geni (burada EGFP) ile birleştirir. Plazmid, rekombinant AAV’ye (rAAV) paketlenir ve bir hayvan modeline enjekte edilir. Buradaki uygulama beyne yapılırken, çeşitli rAAV serotipleri farklı doku tiplerinde enfeksiyona olanak tanır, böylece bu yaklaşım diğer sistemlere genişletilebilir10. Bir süre sonra, beyin toplanabilir ve muhabir geninin ifadesi için test edilebilir. Güçlü ifade, kontrollerle karşılaştırıldığında, test edilen aday dizisinin genin ekspresyonunu “geliştirebildiğini” gösterir (Şekil 1). Bu basit tasarım, beyindeki arttırıcı aktivite için bir diziyi test etmek için kolay ve net bir yaklaşım sunar.

Bir dizinin arttırıcı kabiliyetinin test edilmesine ek olarak, bu yöntem hücre tipi arttırıcı aktivitesini belirlemek için tekniklerle birleştirilebilir. Diferansiyel arttırıcı aktivitesini belirlemeye yönelik sekans tabanlı yaklaşımlarda, DNA ve RNA diziliminden önce hücreleri hücre tipine özgü belirteçler üzerinde sıralamak, araştırmacıların Gisselbrecht ve ark.11’de açıklandığı gibi, farklı hücre tiplerinin diferansiyel arttırıcı aktivite gösterip göstermediğini belirlemelerine izin verebilir. Görüntüleme tabanlı yaklaşımlarda, görüntülerin hücre tipine özgü belirteçlerle birlikte etiketlenmesi, arttırıcı güdümlü floresan sergileyen hücrelerin aynı zamanda ilgilenilen hücre tipi belirteçleri de gösterip göstermediğinin incelenmesine olanak tanır 12,13,14,15,16. Enhancer muhabir testleri, arttırıcılardaki riskle ilişkili allelik varyasyonun, arttırıcı kapasitesi üzerindeki etkileri açısından doğrudan test edilmesini sağlar. Genom çapında ilişkilendirme çalışmalarında (GWAS) tanımlanan risk lokuslarının büyük çoğunluğu, genomun kodlamayan bölgelerinde yatmaktadır17. Bu risk lokuslarının fonksiyonel ek açıklama çalışmaları, büyük bir kısmının muhtemelen arttırıcı olarak hareket ettiğini göstermektedir18,19,20. In vivo MPRA dağıtımı, beyindeki arttırıcı aktivite için bu riskle ilişkili varyantların test edilmesine izin verebilir12,21. Son olarak, farklı zaman noktalarında teslimat ve toplama, bir geliştiricinin aktif olduğu gelişim aşamaları hakkında içgörüler sunabilir.

Geliştirici-muhabir plazmid tasarımları çeşitlidir ve deneysel hedeflere uyacak şekilde özelleştirilebilir. Geliştirici araştırmalarında kullanılan minimal promotörler için insan β-globin minimal promotör22 ve fare Hsp68 minimal promoter23 gibi çeşitli seçenekler vardır. Bu destekleyicilerin, onları etkinleştirmek için bir geliştirici unsurla birleştirilmediği sürece düşük ifade seviyelerini yönlendirdiği bilinmektedir. Buna karşılık, kurucu promotör elemanlar, transgenin güçlü ekspresyonunu yönlendirir, pozitif kontrol için veya güçlendirici fonksiyonu sağlam bir ifadenin arka planına karşı test etmek için kullanışlıdır. Kurucu destekleyiciler için yaygın seçenekler arasında tavuk β aktin promotöründen türetilen hibrit bir promotör olan CAG ve sitomegalovirüs hemen-erken arttırıcı24 veya insan EF1α25 bulunur. Arttırıcıların çift yönlü olarak çalıştığı bilindiğinden26, arttırıcının minimum promotöre göre oryantasyonu ve konumu esnektir (Şekil 2A). Geleneksel geliştirici-muhabir analizleri, geliştiriciyi destekleyicinin yukarı akışını yerleştirir ve kütüphane teslimatlarında, sıralama okumalarını test edilen geliştirici27 ile ilişkilendirmek için muhabir geninin aşağı yönünde bir barkod dizisi içerir. Bununla birlikte, arttırıcılar muhabir geninin açık okuma çerçevesine de yerleştirilebilir ve STARR-seq28’de yapıldığı gibi kendi barkod dizileri olarak hizmet edebilir. Burada açıklanan protokol, STARR-seq tahlil tasarımını kullanır ve aday arttırıcı dizisini muhabir geninin 3′ UTR’sine yerleştirir. STARR-seq oryantasyonu daha akıcı klonlamanın faydasını sunarken, geleneksel yaklaşımdan daha az anlaşılmıştır ve yapılar arasında değişken RNA stabilitesini indükleyebilir. Tarif edilen yöntemler, başka bir yerde tarif edilen klonlama işleminde küçük değişikliklerle STARR-seq veya konvansiyonel yönelime kolayca uyarlanabilir27,29.

Bu tekniği deneysel hedeflere uyacak şekilde daha da özelleştirmek için farklı AAV dağıtım yöntemleri kullanılabilir (Şekil 2B). Bu protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan doğrudan kafa içi enjeksiyonlar, doğrudan beyne yüksek konsantrasyonda virüs verir30. Bu, enjeksiyon bölgesinde merkezlenmiş yüksek bir transdüksiyon verimliliği sağlar, bu da bunu, bir doku alanı üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak isteyen deneyler için mükemmel bir teknik haline getirir. Stereotaktik enjeksiyon, tekrarlanabilir lokalize transdüksiyon için hayvanlar arasında enjeksiyon bölgesini standartlaştırmaya yardımcı olabilir. İntrakraniyal enjeksiyonlar erken postnatal hayvanlarda en basittir. Alternatif bir teknik olarak, sistemik enjeksiyonlar, kan-beyin bariyerini geçebilen serotiplere sahip AAV’leri kullanarak transgenler verebilir31. Kuyruk damarı enjeksiyonları, virüsün vücutta dolaşmasına izin vererek birçok dokuda genelleştirilmiş doğum sağlar10. Retro-orbital enjeksiyonlar, gözün arkasındaki virüsü retro-orbital sinüs32’ye ileten başka bir sistemik enjeksiyon tekniğidir. Bu, AAV için venöz sistemden beyne daha doğrudan bir yol sunar ve beyinde daha periferik kan damarlarına yapılan enjeksiyonlardan daha yüksek bir transdüke hücresi konsantrasyonu ile sonuçlanır33.

Bu tekniğin bir başka esnek yönü de okuma yöntemidir. Genel olarak, seçenekler muhabir tabanlı veya sıralama tabanlı olarak tanımlanabilir (Şekil 2C). GFP gibi bir floresan muhabirini yapının açık okuma çerçevesine dahil etmek, aday arttırıcının ifadeyi sürdüğü herhangi bir dönüştürülmüş hücrede floresan proteininin ekspresyonuyla sonuçlanır. İmmünohistokimya gibi etiketleme ve görüntüleme teknikleri sinyal amplifikasyonunu mümkün kılar. Dizileme tabanlı okuma teknikleri, dokudan toplanan RNA’da verilen yapıdan dizileri tanımlamayı içerir. Başlangıçta teslim edilen viral DNA miktarını ölçerek, eksprese edilen RNA ile verilen DNA’nın karşılaştırılması, test edilmiş bir arttırıcı dizisinin, örneğin kitlesel olarak paralel bir muhabir testi (MPRA) bağlamında, transgenin artan ekspresyonunu ne derece yönlendirebildiğini belirlemek için kullanılabilir. MPRA’lar, aynı anda aktivite için binlerce aday arttırıcıyı test etmek için bu tekniklerin güçlü bir genişlemesini sunar ve genomik araştırmalarda 12,27,34,35,36 kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Aday arttırıcılar için klonlama, paketleme, teslimat ve sıralama adımlarının tek tek değil, toplu olarak gerçekleştirilmesiyle daha yüksek verim taraması elde edilir.

Aday geliştirici seçimi, esneklik için başka bir fırsat sağlar (Şekil 2D). Örneğin, bu tahlil, belirli bir genin arttırıcılarını tanımlamak, ilgilenilen kodlamayan DNA bölgelerinin işlevini belirlemek veya bir arttırıcının aktif olduğu spesifik hücre tiplerini veya gelişim aşamalarını belirlemek için kullanılabilir – bunların hepsi hem temel bilimde hem de hastalık araştırmalarında hedeflere hizmet eder. Genel olarak, aday arttırıcı seçimi, arttırıcı aktivitenin in silico tahminleri tarafından yönlendirilir. Yaygın olarak, in silico tahminleri, H3K27ac37 ve kromatin erişilebilirlik haritalaması38 gibi olası arttırıcıları gösteren histon modifikasyonları için ChIP-seq’i içerir. Son olarak, büyüyen bir araştırma alanı, sentetik olarak tasarlanmış arttırıcı elemanların fonksiyon tabanlı taranmasıdır, bu da arttırıcı dizinin fonksiyon39’u nasıl yönlendirdiğine ve belirli özelliklere sahip arttırıcıların tasarımına dair çalışmalara olanak tanır40.

Protocol

Bu protokol, UC Davis Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol #22339) ve UC Davis Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (BUA-R1903) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, doğum sonrası 0-1. günde her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri üzerinde test edilmiştir. 1. Arttırıcı aday dizisini AAV vektör plazmidine klonlayın. NOT: Temsili protokoller verilmiştir, ancak klonlama stratejisi yüksek derecede esnekliğe sahiptir….

Representative Results

Bu yöntemler kullanılarak, CACNA1C 19,49,50 geninin psikiyatrik riskle ilişkili üçüncü intronunda 915 bp dizisi, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı aktivite açısından test edildi. Bu sekans, psikiyatrik ve nörolojik risk SNP’leri12’ye odaklanan 345 aday arttırıcı sekanstan oluşan bir MPRA’da keşfedilmiştir ve karakterizasyon deneyleri burada genel bir örnek olarak açık…

Discussion

Bu protokol, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı güdümlü transgenlerin konuşlandırılması için rAAV tabanlı bir yöntemi açıklar. Bu genelleştirilmiş protokolde, bir aday arttırıcı, bir minimal destekleyici, bir muhabir geni ve isteğe bağlı bir barkod dizisi bir AAV plazmid omurgasına klonlanır. Bu deneyler tek bir aday arttırıcı dizisi ile veya paralel olarak birçok dizi ile yapılabilir. Plazmid bir rAAV içine paketlenir ve doğum sonrası fare beynine verilir. Virüs transdüksiyonuna i…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UC Davis DNA Technologies Core’da dizileme yapıldı. UC Davis’teki Lin Tian laboratuvarına, rAAV ambalajı konusunda eğitim aldıkları ve bize AAV yardımcısı ve rep / cap plazmidlerini cömertçe hediye ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIGMS R35GM119831 tarafından desteklenmiştir.

Materials

10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L., Parrot, S., Denoroy, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. 130, 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -. Y., Kuo, H. -. Y., Liu, F. -. C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -. L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -. S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

AAVEnhancerExpressionReporterConstructCloningPCRGibson CloningPlasmidVirus TiterIn VivoMouse Brain
check_url/fr/62650?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image