Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Summary

Les tissus primaires obtenus chez les patients après une arthroplastie totale du genou fournissent un modèle expérimental pour la recherche sur l’arthrose avec une translatabilité clinique maximale. Ce protocole décrit comment identifier, traiter et isoler l’ARN de sept tissus uniques du genou pour soutenir la recherche mécaniste dans l’arthrose humaine.

Abstract

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique et dégénérative qui affecte le plus souvent le genou. Comme il n’existe actuellement aucun remède, l’arthroplastie totale du genou (ATK) est une intervention chirurgicale courante. Des expériences utilisant des tissus d’arthrose humaine primaires obtenus à partir de TKA fournissent la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie ex vivo. Alors que l’arthrose était auparavant considérée comme ayant un impact principalement sur le cartilage, on sait maintenant qu’elle affecte plusieurs tissus de l’articulation. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (basé sur la pureté, l’intégrité et le rendement de l’ARN) de chacun des sept tissus uniques pour soutenir l’investigation du mécanisme de la maladie dans l’articulation du genou. Avec le consentement éclairé, des échantillons ont été prélevés sur des patients souffrant d’ATK pour l’arthrose. Les tissus ont été disséqués, lavés et stockés dans les 4 heures qui ont suivi la chirurgie par congélation éclair pour la fixation de l’ARN ou du form formel pour l’histologie. Les tissus prélevés comprenaient le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, le ménisque, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis. Des protocoles d’extraction d’ARN ont été testés pour chaque type de tissu. La modification la plus importante concernait la méthode de désintégration utilisée pour les tissus durs à cellules basses et à matrice élevée (considérés comme cartilage, os et ménisque) par rapport aux tissus mous à cellules relativement hautes et à matrice basse (considérés comme coussinet adipeux, ligament, synoviale et muscle). Il a été constaté que la pulvérisation était appropriée pour les tissus durs et que l’homogénéisation était appropriée pour les tissus mous. Une propension de certains sujets à produire des valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) plus élevées que d’autres sujets de manière cohérente dans plusieurs tissus a été observée, suggérant que des facteurs sous-jacents tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN. La capacité d’isoler de l’ARN de haute qualité à partir de tissus humains primaires d’arthrose fournit un modèle physiologiquement pertinent pour des expériences sophistiquées d’expression génique, y compris le séquençage, qui peuvent conduire à des connaissances cliniques qui sont plus facilement traduites pour les patients.

Introduction

Le genou est la plus grande articulation synoviale du corps humain, comprenant l’articulation tibofemorale entre le tibia et le fémur et l’articulation fémoro-patellaire entre la rotule et le fémur¹. Les os du genou sont tapissés de cartilage articulaire et soutenus par divers tissus conjonctifs, y compris les méniques, la graisse, les ligaments et les muscles, et une membrane synoviale encapsule toute l’articulation pour créer une cavité remplie de liquide synovial^1,2,3 ( Figure1). Un genou sain fonctionne comme une articulation de charnière mobile qui permet un mouvement sans friction dans le plan frontal^1,3. Dans des conditions pathologiques, les mouvements peuvent devenir restreints et douloureux. La maladie dégénérative de l’articulation du genou la plus courante est l’arthrose (OA)⁴. Une variété de facteurs de risque sont connus pour prédisposer au développement de l’arthrose, y compris l’âge avancé, l’obésité, le sexe féminin, les traumatismes articulaires et la génétique, entre autres^5,6. On estime actuellement à 14 millions le nombre de personnes atteintes d’arthrose symptomatique du genou aux États-Unis, la prévalence augmentant en raison de l’augmentation de l’âge de la population et des taux d’obésité^7,8. Initialement considérée comme une maladie du cartilage, l’arthrose est maintenant comprise comme une maladie de l’ensemble de l’articulation⁹. Les changements pathologiques couramment observés dans l’arthrose comprennent l’érosion du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, l’épaississement osseux sous-chondral et l’inflammation de la synoviale^9,10. Comme il n’existe pas de remède connu pour l’arthrose, les traitements se concentrent principalement sur la gestion des symptômes (par exemple, la douleur)^11,12, et une fois que l’arthrose a progressé au stade final, la chirurgie de remplacement articulaire est souvent indiquée¹³.

Les chirurgies de remplacement articulaire peuvent être des arthroplasties partielles ou totales du genou, avec une arthroplastie totale du genou (TKA), y compris le remplacement de toute l’articulation tibofémorale et de l’articulation fémoro-patellaire. En 2020, environ 1 million de TKA sont effectuées aux États-Unis chaque année¹⁴. Au cours de l’ATK, un chirurgien orthopédiste réséque la partie supérieure du plateau tibial et les condyles fémoraux inférieurs(Figure 2A,2B)à équiper d’implants prothétiques. Parfois mal interprété par les patients, dans un TKA, seulement 8-10 mm sont réséqués à partir de l’extrémité de chaque os, qui est ensuite coiffé ou resurfacé, avec du métal. Une doublure en polyéthylène interposée forme la surface de roulement (c.-à-d. le rembourrage) entre les deux implants métalliques. En outre, plusieurs composants des tissus mous de l’articulation sont entièrement ou partiellement excisés pour atteindre un bon équilibre articulaire. Parmi ces tissus figurent les ménesques médiaux et latéraux(Figure 2C),le coussinet adipeux infrapellaire(Figure 2D),le ligament croisé antérieur (LCA; Figure 2E), synoviale (Figure 2F) et muscle oblique vastus medialis (VMO; Figure 2G) ¹⁵. Bien que les ENTK réussissent généralement pour le traitement de l’arthrose, environ 20% des patients signalent une réapparition de la douleur après la chirurgie¹⁶. En plus du coût élevé et du caractère relativement invasif de la procédure, ces limites soulignent la nécessité de recherches supplémentaires pour identifier d’autres traitements afin d’atténuer la progression de l’arthrose.

Pour explorer les mécanismes pathologiques de l’arthrose qui peuvent présenter de nouvelles voies d’intervention thérapeutique, des systèmes expérimentaux, y compris des cellules, des explants tissulaires et des modèles animaux, peuvent être utilisés. Les cellules sont généralement cultivées en monocouche et sont dérivées de tissus humains ou animaux primaires (par exemple, des chondrocytes isolés du cartilage) ou de cellules immortalisées (par exemple, ATDC5¹⁷ et CHON-001¹⁸). Bien que les cellules puissent être utiles pour manipuler des variables expérimentales dans un environnement de culture contrôlée, elles ne capturent pas les conditions de l’articulation naturelle qui sont connues pour avoir un impact sur les phénotypes cellulaires¹⁹. Pour mieux récapituler la cascade complexe de communication chimique, mécanique et cellulaire à cellule sous-jacente à l’arthrose, une alternative est trouvée dans les échantillons de tissus humains ou animaux primaires, qu’ils soient utilisés frais ou cultivés ex vivo comme explants, pour préserver la structure tissulaire et le microenvironnement cellulaire²⁰. Afin d’étudier l’articulation in vivo,de petits modèles animaux (p. ex., souris²¹) et grands (p. ex., cheval²²⁾pour l’arthrose (p. ex., induction chirurgicale, altération génétique ou vieillissement) sont également utiles. Cependant, la traduction de ces modèles à la maladie humaine peut être limitée par des différences anatomiques, physiologiques et métaboliques, entre autres²³. Compte tenu des avantages et des inconvénients des systèmes expérimentaux, les principaux atouts d’être spécifiques à l’espèce et de maintenir la niche extracellulaire offerte par les principaux tissus humains d’arthrose maximisent le potentiel translationnel des résultats de la recherche.

Les tissus humains primaires d’arthrose peuvent être facilement obtenus après l’ATK, ce qui fait de la fréquence élevée des ATK une ressource précieuse pour la recherche. Parmi les applications expérimentales potentielles figurent l’expression génique et les analyses histologiques. Pour réaliser le potentiel des tissus humains primaires d’arthrose pour ces approches de recherche et d’autres, les considérations clés suivantes sont décrites. Premièrement, l’utilisation d’échantillons de patients est assujettie à une réglementation éthique, et les protocoles doivent être conformes aux approbations de la Commission d’examen institutionnel^{(CISR) 24}. Deuxièmement, l’hétérogénéité inhérente des tissus humains primaires malades et l’influence de variables telles que l’âge et le sexe, entre autres, créent la nécessité d’une sélection minutieuse des patients (c.-à-d. l’application de critères d’admissibilité) et d’une interprétation des données. Troisièmement, les propriétés biologiques uniques de différents tissus de l’articulation (p. ex., faible cellularité du cartilage et du ménisque²⁵⁾peuvent présenter des défis lors d’expériences (p. ex., isoler une qualité et une quantité élevées d’ARN). Le présent rapport aborde ces considérations et présente un protocole pour la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (c.-à-d. évaluation de la pureté et de l’intégrité de l’ARN; Graphique 3) encourager l’utilisation de tissus humains primaires d’arthrose dans le milieu de la recherche.

Protocol

Ce protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices institutionnelles établies par le Henry Ford Health System Institutional Review Board (CISR no 13995). 1. Sélection des patients Identifiez les patients parmi ceux qui doivent subir une ATK avec un chirurgien orthopédiste. Sélectionnez les patients en fonction des critères d’éligibilité définis par le protocole de l’étude. Des exemples de critères d’inclusion comprennent le fait d’…

Representative Results

Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain sont disponibles pour la collecte de patients souffrant d’ATK pour l’arthrose (Figure 1). Dans ce protocole, chacun de ces tissus a été identifié et traité dans les 4 heures suivant l’ablation chirurgicale (Figure 2). En suivant les étapes décrites à la figure 3,des parties de chaque tissu ont été fixées au for formel pour l’évaluation histologique (<strong c…

Discussion

Le protocole présenté s’est avéré efficace pour la collecte de sept tissus humains primaires d’arthrose pour l’extraction de l’ARN (Tableau 1) et le traitement histologique (Figure 4). Avant de prélever des échantillons de patients, il est nécessaire d’établir un protocole approuvé par la CISR, idéalement en collaboration avec un chirurgien ou une équipe chirurgicale. L’application d’un protocole normalisé pour le prélèvement d’échantillons (p….

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.