Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano
Summary
I tessuti primari ottenuti da pazienti dopo artroplastica totale del ginocchio forniscono un modello sperimentale per la ricerca sull’osteoartrite con la massima traducibilità clinica. Questo protocollo descrive come identificare, elaborare e isolare l’RNA da sette tessuti del ginocchio unici per supportare l’indagine meccanicistica nell’osteoartrite umana.
Abstract
L’osteoartrite (OA) è una malattia articolare cronica e degenerativa che colpisce più spesso il ginocchio. Poiché attualmente non esiste una cura, l’artroplastica totale del ginocchio (TKA) è un intervento chirurgico comune. Esperimenti che utilizzano tessuti OA umani primari ottenuti da TKA forniscono la capacità di studiare i meccanismi della malattia ex vivo. Mentre in precedenza si pensava che l’OA impattasse principalmente sulla cartilagine, ora è noto che ha un impatto su più tessuti nell’articolazione. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l’elaborazione dei campioni, l’omogeneizzazione dei tessuti, l’estrazione dell’RNA e il controllo di qualità (basato sulla purezza, l’integrità e la resa dell’RNA) da ciascuno dei sette tessuti unici per supportare l’indagine del meccanismo della malattia nell’articolazione del ginocchio. Con il consenso informato, i campioni sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a TKA per OA. I tessuti sono stati sezionati, lavati e conservati entro 4 ore dall’intervento chirurgico mediante congelamento flash per la fissazione dell’RNA o della formalina per l’istologia. I tessuti raccolti includevano cartilagine articolare, osso subcondrale, menisco, cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e muscolo obliquo vastus medialis. I protocolli di estrazione dell’RNA sono stati testati per ogni tipo di tessuto. La modifica più significativa ha coinvolto il metodo di disintegrazione utilizzato per i tessuti duri a bassa cellula, ad alta matrice (considerati come cartilagine, ossa e menisco) rispetto ai tessuti molli relativamente ad alta cellula, a bassa matrice (considerati come cuscinetto di grasso, legamento, sinovia e muscolo). Si è scoperto che la polverizzazione era appropriata per i tessuti duri e l’omogeneizzazione era appropriata per i tessuti molli. È stata osservata una propensione per alcuni soggetti a produrre valori più elevati di numero di integrità dell’RNA (RIN) rispetto ad altri soggetti in modo coerente su più tessuti, suggerendo che fattori sottostanti come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell’RNA. La capacità di isolare RNA di alta qualità dai tessuti OA umani primari fornisce un modello fisiologicamente rilevante per sofisticati esperimenti di espressione genica, incluso il sequenziamento, che possono portare a intuizioni cliniche che sono più facilmente tradotte per i pazienti.
Introduction
Il ginocchio è la più grande articolazione sinoviale del corpo umano, comprendente l’articolazione tibiofemorale tra la tibia e il femore e l’articolazione femoro-rotula tra la rotula e il femore1. Le ossa del ginocchio sono rivestite con cartilagine articolare e supportate da vari tessuti connettivi, tra cui menischi, grasso, legamenti e muscoli, e una membrana sinoviale incapsula l’intera articolazione per creare una cavità piena di liquido sinoviale1,2,3 ( Figura1). Un ginocchio sano funziona come un’articolazione a cerniera mobile che consente un movimento senza attrito nel piano frontale1,3. In condizioni patologiche, il movimento può diventare limitato e doloroso. La malattia degenerativa dell’articolazione del ginocchio più comune è l’osteoartrite (OA)4. Una varietà di fattori di rischio sono noti per predisporre allo sviluppo di OA, tra cui età avanzata, obesità, sesso femminile, traumi articolari e genetica, tra gli altri5,6. Attualmente ci sono circa 14 milioni di persone negli Stati Uniti con OA sintomatica del ginocchio, con la prevalenza in aumento a causa dell’aumento dell’età della popolazione e dei tassi di obesità7,8. Inizialmente considerata una malattia della cartilagine, l’OA è ora intesa come una malattia dell’intera articolazione9. I cambiamenti patologici comunemente osservati nell’OA includono l’erosione della cartilagine articolare, la formazione di osteofiti, l’ispessimento osseo subcondrale e l’infiammazione della sinovia9,10. Poiché non esiste una cura nota per l’OA, i trattamenti si concentrano principalmente sulla gestione dei sintomi (ad esempio, dolore)11,12e una volta che l’OA è progredito allo stadio finale, la chirurgia di sostituzione articolare è spesso indicata13.
Gli interventi chirurgici di sostituzione articolare possono essere sostituzioni parziali o totali del ginocchio, con artroplastica totale del ginocchio (TKA) che include la sostituzione dell’intera articolazione tibiofemorale e dell’articolazione femoro-rotula. A partire dal 2020, circa 1 milione di TKA vengono eseguiti negli Stati Uniti ogni anno14. Durante la TKA, un chirurgo ortopedico risente la porzione superiore del plateau tibiale e i condili femorali inferiori(Figura 2A,2B)per essere dotato di impianti protesici. A volte male interpretato dai pazienti, in un TKA, solo 8-10 mm vengono resecati dall’estremità di ciascun osso, che viene successivamente tappato o riaffiolato, con metallo. Un rivestimento in polietilene interposto forma la superficie del cuscinetto (cioè l’imbottitura) tra i due impianti metallici. Inoltre, diversi componenti dei tessuti molli dell’articolazione vengono completamente o parzialmente asportati per ottenere un corretto equilibrio articolare. Tra questi tessuti ci sono i menisci mediali e laterali (Figura 2C), cuscinetto di grasso infrapatellare (Figura 2D), legamento crociato anteriore (LCA; Figura 2E), sinovia (Figura 2F) e muscolo obliquo vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Sebbene i TCA siano generalmente efficaci per il trattamento con OA, circa il 20% dei pazienti riferisce il ripetersi del dolore dopo l’intervento chirurgico16. Insieme all’alto costo e alla relativa invasività della procedura, queste limitazioni indicano la necessità di ulteriori ricerche per identificare trattamenti alternativi per mitigare la progressione dell’OA.
Per esplorare i meccanismi di malattia nell’OA che possono presentare nuove strade per l’intervento terapeutico, possono essere utilizzati sistemi sperimentali, tra cui cellule, espianti tissutali e modelli animali. Le cellule sono tipicamente coltivate in monostrato e sono derivate da tessuti primari umani o animali (ad esempio, condrociti isolati dalla cartilagine) o cellule immortalizzate (ad esempio, ATDC517 e CHON-00118). Mentre le cellule possono essere utili per manipolare variabili sperimentali in un ambiente di coltura controllato, non catturano le condizioni dell’articolazione naturale che sono note per avere un impatto sui fenotipi cellulari19. Per ricapitolare meglio la complessa cascata di comunicazione chimica, meccanica e cellula-cellula alla base dell’OA, un’alternativa si trova nei campioni primari di tessuto umano o animale, utilizzati freschi o coltivati ex vivo come espianti, per preservare la struttura tissutale e il microambiente cellulare20. Per studiare l’articolazione in vivo,sono utili anche modelli animali piccoli (ad esempio, topo21) e grandi (ad esempio, cavallo22) per OA (ad esempio, attraverso l’induzione chirurgica, l’alterazione genetica o l’invecchiamento). Tuttavia, la traduzione da questi modelli alla malattia umana può essere limitata da differenze anatomiche, fisiologiche e metaboliche, tra gli altri23. Considerando i vantaggi e gli svantaggi dei sistemi sperimentali, i punti di forza chiave di essere specie-specifici e mantenere la nicchia extracellulare offerta dai tessuti OA umani primari massimizzano il potenziale traslazionale dei risultati della ricerca.
I tessuti OA umani primari possono essere facilmente ottenuti dopo TKA, rendendo l’alta frequenza di TKA una risorsa preziosa per la ricerca. Tra le potenziali applicazioni sperimentali ci sono l’espressione genica e le analisi istologiche. Per realizzare il potenziale dei tessuti OA umani primari per questi approcci di ricerca e altri, delineati sono le seguenti considerazioni chiave. In primo luogo, l’uso di campioni di pazienti è soggetto a regolamentazione etica e i protocolli devono soddisfare le approvazioni dell’Institutional Review Board (IRB)24. In secondo luogo, l’eterogeneità intrinseca dei tessuti primari umani malattia e l’influenza di variabili come l’età e il sesso, tra gli altri, creano la necessità di un’attenta selezione del paziente (cioè l’applicazione di criteri di ammissibilità) e l’interpretazione dei dati. In terzo luogo, le proprietà biologiche uniche di diversi tessuti dell’articolazione (ad esempio, bassa cellularità della cartilagine e del menisco25)possono presentare sfide durante gli esperimenti (ad esempio, isolando alta qualità e quantità di RNA). Questo rapporto affronta queste considerazioni e presenta un protocollo per la selezione del paziente, l’elaborazione dei campioni, l’omogeneizzazione dei tessuti, l’estrazione dell’RNA e il controllo di qualità (cioè la valutazione della purezza e dell’integrità dell’RNA; Figura 3) incoraggiare l’uso di tessuti OA umani primari nella comunità di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato si è dimostrato efficace per la raccolta di sette tessuti OA umani primari per l’estrazione dell’RNA (Tabella 1) e l’elaborazione istologica (Figura 4). Prima di raccogliere i campioni dei pazienti, è necessario stabilire un protocollo approvato dall’IRB, idealmente in collaborazione con un chirurgo o un team chirurgico. L’applicazione di un protocollo standardizzato per la raccolta dei campioni (ad esempio, la resezione da posizioni coerenti i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i partecipanti allo studio che hanno reso possibile questa ricerca e dedicano questo rapporto a nuovi scienziati nel campo dell’osteoartrite.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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