Isolering av aktiv caenorhabditis elegans kärnextrakt och rekonstitution för in vitro-transkription

Summary

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera aktiva kärnämne extrakt från larv steg 4 C. elegans och visualisera transkription verksamhet i ett in vitro system.

Abstract

Caenorhabditis elegans har varit ett viktigt modellsystem för biologisk forskning sedan det infördes 1963. C. elegans har dock inte utnyttjats fullt ut i den biokemiska studien av biologiska reaktioner med hjälp av dess kärnextrakt såsom in vitro-transkription och DNA-replikering. Ett betydande hinder för att använda C. elegans i biokemiska studier stör nematodens tjocka yttre nagelband utan att offra aktiviteten hos kärnextraktet. Medan flera metoder används för att bryta nagelbandet, såsom Dounce homogenisering eller ultraljudsbehandling, leder de ofta till proteininstabilitet. Det finns inga etablerade protokoll för att isolera aktiva nukleära proteiner från larva eller vuxen C. elegans för in vitro reaktioner . Här beskriver protokollet i detalj homogeniseringen av larvstadium 4 C. elegans med hjälp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator använder tryck för att långsamt tvinga djuren genom ett smalt mellanrum som bryter nagelbandet i processen. Balch homogenisators enhetliga konstruktion och exakta bearbetning möjliggör konsekvent slipning av djur mellan experimenten. Fraktionering av homogenatet som erhålls från Balch homogenisator ger funktionellt aktiva kärnextrakt som kan användas i en in vitro-metod för att analysera transkriptionsaktiviteten hos C. elegans.

Introduction

Den lilla, frilevande nematoden Caenorhabditis elegans är en enkel men kraftfull modellorganism för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor. Sedan introduktionen 1963 har nematoderna varit ovärderliga för att svara på frågor inom neurobiologi, metabolism, åldrande, utveckling, immunitet och ^genetik1. Några av djurets många egenskaper som gör det till en idealisk modellorganism inkluderar kort generationstid, effektiviteten av RNA-interferens, transparent kropp och de färdiga kartorna över både dess cellulära härstamning och nervsystem.

Medan nematodens bidrag till vetenskapen är enorma, har de underutnyttjats för att klargöra det eukaryota transkriptionssystemet, med det mesta av vår förståelse för dessa mekanismer som kommer från studier med kärnextrakt från jäst, fruktfluga och däggdjurscellkultur2. Det största hindret som avskräcker forskare från att utvinna funktionellt kärnextrakt är nematodens tuffa yttre nagelband. Detta exoskelett består av korslänkade kollagener, cuticlins, glykoproteiner och lipider, vilket gör C. elegans från larvstadium till vuxen ålder resistent mot proteinutvinning via kemiska eller mekaniska ^krafter3. Ett in vitro transkriptionssystem med C. elegans kärnextrakt utvecklades en gång men inte allmänt antogs på grund av systemets begränsade omfattning, och användningen av Dounce homogenizer för att förbereda extraktet kan leda till protein ^{instabilitet4,5}.

Till skillnad från det tidigare protokollet för kärnextraktisolering som använde en Dounce homogenisator för att bryta C. elegans, använder detta protokoll en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av två huvudkomponenter: en volframkarbidboll och ett rostfritt stålblock med en kanal uttråkad från ena änden till en annan. Balch homogenisator är laddad med volframkarbidbollen och täckt på vardera sidan för att försegla slipkammaren. Sprutor kan laddas på de två vertikala portarna som leder in i slipkammaren. När materialet överförs från en spruta till en annan genom slipkammaren tvingar trycket från sprutorna materialet genom ett smalt mellanrum mellan bollen och kammarens vägg. Detta långsamma och konstanta tryck bryter materialet tills det når en jämn storlek som lätt kan passera genom det smala gapet. Att tvinga C. elegans genom det smala gapet via ett konstant men ändå mjukt tryck bryter djuren öppna och släpper ut deras innehåll i den omgivande bufferten. Om du byter bollstorlekar skärps gapet ytterligare, de nyutgivna cellerna bryts och kärnorna frigörs i bufferten. Flera fall av centrifugering separerar kärnorna från resten av cellskräpet, vilket möjliggör insamling av ett rent kärnextrakt. Balch homogenisator föredras framför Dounce homogenisator av flera skäl: systemet kan hantera ett stort antal djur, vilket gör det möjligt att extrahera en hög mängd aktiva proteiner i ett enda försök; Den exakta bearbetningen av bollarna och stålblocket möjliggör konsekvent slipning mellan flera prover. det tunga stålblocket fungerar som en kylfläns och drar jämnt bort värme från slipkammaren, vilket förhindrar denaturering.

Efter isolering måste transkriptionsaktiviteten av kärnextrakt verifieras innan den används i några biokemiska experiment. Traditionellt mättes transkriptionsaktivitet med hjälp av radiomärkta nukleotider för att spåra och visualisera det nyligen syntetiserade RNA. Radioaktiv märkning kan dock vara betungande eftersom det kräver försiktighet vid användning och ^{bortskaffande6}. Tekniska framsteg gör det möjligt för forskare idag att använda mycket mindre skadliga eller besvärliga metoder för att mäta även små RNA-mängder med hjälp av tekniker som kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR)⁷. Här beskriver protokollet en metod för att isolera aktiva kärnextrakt från larvstadium 4 (L4) C. elegans och visualisera transkriptionsaktivitet i ett in vitro-system.

Protocol

1. Medieförberedelser Förbered sterila lysogena buljongplattor (LB) och flytande medier enligt tillverkarens instruktioner. Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 på en LB agar tallrik. Inkubera bakteriestrimmen vid 37 °C över natten. Förvara E. coli OP50-streckplattan vid 4 °C efter inkubation. E. coli OP50-plattan kan förvaras säkert vid 4 °C i 2 veckor om den är insvept i parafilm för att förhindra fuktförlust. Förbered 2 L…

Representative Results

Enligt de skisserade stegen bör ge funktionellt kärnextrakt (figur 1) kan avvikelse i slip- eller tvättstegen leda till dålig aktivitet eller låg avkastning. Om funktionellT C. elegans kärnextrakt erhålls kommer det att transkribera regionen nedströms CMV-promotorn på DNA-mallen när den läggs till i den tidigare beskrivna in vitro-analysen . Den resulterande RNA-transkriptionen kan renas från kärnproteinerna och DNA-mallen med …

Discussion

C. elegans är en tilltalande modellorganism för att studera det eukaryota transkriptionssystemet på grund av dess billiga underhåll och den enkla genetiska manipulationen. Här beskrivs ett protokoll för konsekvent isolering av funktionellt aktiva kärnämne extrakt från L4 C. elegans . Även om detta protokoll fokuserade på att visualisera transkription verksamhet, cDNA produceras post-transcriptionally kan kvantifieras med RT-qPCR för att få en mer exakt mätning av transkription <sup class="…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010