Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Summary

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Caenorhabditis elegans, 1963 yılında piyasaya sürüldüldüklerinden beri biyolojik araştırmalar için önemli bir model sistemidir. Bununla birlikte, C. elegans, in vitro transkripsiyon ve DNA replikasyon gibi nükleer özlerini kullanarak biyolojik reaksiyonların biyokimyasal çalışmasında tam olarak kullanılmamıştır. Biyokimyasal çalışmalarda C. elegans’ı kullanmanın önemli bir engeli, nükleer özün aktivitesini feda etmeden nematodun kalın dış kütikülünü bozuyor. Kıtkeni kırmak için Dounce homojenizasyon veya sonication gibi çeşitli yöntemler kullanılırken, genellikle protein kararsızlığına yol açarlar. Aktif nükleer proteinlerin in vitro reaksiyonlar için larva veya yetişkin C. eleganlardan izole edilmesi için belirlenmiş bir protokol yoktur. Burada protokol, larva evresi 4 C. eleganların balç homojenizatörü kullanılarak homojenizasyonunu ayrıntılı olarak açıklar. Balch homojenizatör, hayvanları bu süreçte kütikülleri kıran dar bir boşluktan yavaşça zorlamak için basınç kullanır. Balch homojenizatörün düzgün tasarımı ve hassas işlenmesi, deneyler arasında hayvanların tutarlı bir şekilde taşlanmasına izin verir. Balch homojenizatörden elde edilen homojenatın fraksiyone edilmesi, C. eleganların transkripsiyon aktivitesini test etmek için bir in vitro yöntemde kullanılabilecek işlevsel olarak aktif nükleer ekstrakt sağlar.

Introduction

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963’te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve ^genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.

Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon sistemini aydınlatmak için yetenmemiştir, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızın çoğu maya, meyve sineği ve memeli hücre kültüründen nükleer ekstrakt kullanan çalışmalardan ^gelmektedir2. Araştırmacıları fonksiyonel nükleer özüt çıkarmaktan vazgeçiren en büyük engel nematodun sert dış manikürüdür. Bu dış iskelet çapraz bağlı kollajenler, cuticlins, glikoproteinler ve lipitlerden oluşur ve C. eleganları larva aşamasından yetişkinliğe kadar kimyasal veya mekanik kuvvetlerle protein ekstraksiyona dayanıklı hale ^getirir3. C. elegans nükleer ekstresi kullanan bir in vitro transkripsiyon sistemi bir zamanlar geliştirilmiştir, ancak sistemin sınırlı kapsamı nedeniyle yaygın olarak benimsenmemiştir ve özü hazırlamak için Dounce homojenizatörün kullanılması protein kararsızlığına yol ^açabilir4,5.

C. eleganları kırmak için bir Dounce homojenizatör kullanan nükleer ekstrakt izolasyonu için önceki protokolün aksine, bu protokol bir Balch homojenizatör kullanır. Balch homojenizatör iki ana bileşenden oluşur: bir tungsten karbür topu ve bir uçtan diğerine sıkılmış bir kanala sahip paslanmaz çelik bir blok. Balch homojenizatörü tungsten karbür topu ile yüklenir ve taşlama odasını kapatmak için her iki tarafa da kapatılmıştır. Şırınnalar, taşlama odasına giden iki dikey bağlantı noktasına yüklenebilir. Malzeme bir şırınnadan diğerine taşlama odasından geçirilirken, şırınnalardan gelen basınç malzemeyi top ile odanın duvarı arasındaki dar bir boşluktan geçirir. Bu yavaş ve sabit basınç, dar boşluktan kolayca geçebilen tutarlı bir boyuta ulaşana kadar malzemeyi kırar. C. elegans’ı sürekli ama yumuşak bir basınçla dar boşluktan zorlamak, hayvanları açar ve içeriklerini çevredeki tampona bırakır. Top boyutlarının değiştirilmesi boşluğu daha da sıkılaştırarak yeni salınan hücreleri kırar ve çekirdeği tampona boşaltır. Santrifüjlemenin birden fazla örneği çekirdekleri hücre kalıntılarının geri kalanından ayırarak temiz bir nükleer özün toplanmasına izin verir. Balch homojenizatör, Dounce homojenizatöre göre birkaç nedenden dolayı tercih edilir: sistem çok sayıda hayvanı idare edebilir ve tek bir denemede yüksek miktarda aktif protein çıkarmayı mümkün hale getirir; topların ve çelik bloğun hassas işlenmesi, birden fazla numune arasında tutarlı taşlama sağlar; ağır çelik blok bir ısı emici görevi görür, ısıyı taşlama odasından düzgün bir şekilde çeker ve denatüre etmeyi önler.

İzolasyondan sonra, nükleer ekstrakt transkripsiyon aktivitesi herhangi bir biyokimyasal deneyde kullanılmadan önce doğrulanmalıdır. Geleneksel olarak, transkripsiyon aktivitesi, yeni sentezlenen RNA’yı izlemek ve görselleştirmek için radyolabelli nükleotidler kullanılarak ölçüldü. Bununla birlikte, radyoaktif etiketleme, kullanım ve bertaraf sırasında önlem gerektirdiği için külfetli ^olabilir6. Günümüzde teknolojik gelişmeler, araştırmacıların nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)⁷ gibi teknikleri kullanarak küçük RNA miktarlarını bile ölçmek için çok daha az zararlı veya zahmetli yöntemler kullanmalarına izin verir. Burada protokol, aktif nükleer özü larva evresi 4 (L4) C. eleganlardan izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Protocol

1. Medya hazırlıkları Üreticinin talimatlarına uyarak steril lysogeny et suyu (LB) agar plakaları ve sıvı ortam hazırlayın. Çizgi Escherichia coli (E. coli) bir LB agar plakası üzerinde OP50 suş. Bakteri çizgisini bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın. E. coli OP50 çizgi plakasını kuluçkadan sonra 4 °C’de saklayın. E. coli OP50 plaka, nem kaybını önlemek için parafilme sarılırsa 2 hafta boyunca 4 °C’de güvenle saklanabilir….

Representative Results

Özetlenen adımların ardından fonksiyonel nükleer ekstrakt (Şekil 1) verilmelidir, taşlama veya yıkama adımlarındaki sapma zayıf aktiviteye veya düşük verime yol açabilir. Fonksiyonel C. elegans nükleer özü elde edilirse, daha önce açıklanan in vitro teste eklendiğinde CMV promotörünün bölgesini DNA şablonuna aşağı doğru yazıya dökecektir. Elde edilen RNA transkript, geleneksel yöntemler kullanılarak nükle…

Discussion

C. elegans , düşük maliyetli bakımı ve genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle ökaryotik transkripsiyon sistemini incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada L4 C. elegans fonksiyonel olarak aktif nükleer özün tutarlı izolasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol transkripsiyon etkinliğini görselleştirmeye odaklansa da, transkripsiyon aktivitesinin daha hassas bir ölçümünü elde etmek için transkripsiyon sonrası üretilen cDNA RT-qPCR kullanılarak <su…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010