Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Summary

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.

Introduction

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и ^{генетике1}. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.

Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток ^{млекопитающих2}. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических ^сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности ^{белка4,5}.

В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.

После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и ^{удаления6}. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)⁷. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.

Protocol

1. Подготовка СМИ

1. Приготовьте стерильный лизогенный бульон (LB) агаровые пластины и жидкие среды, следуя инструкциям производителя.
2. Полоса кишечной палочки (E. coli) штамм OP50 на агаровой пластине LB. Инкубируйте полосу бактерий при 37 °C в течение ночи.
3. Храните пластину E. coli OP50 при температуре 4 °C после инкубации. Пластину E. coli OP50 можно безопасно хранить при 4 °C в течение 2 недель, если завернуть в парапленку для предотвращения потери влаги.
4. Приготовьте 2 л среды для роста нематод (NGM), используя рецепт, приведенный в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нистатин является необязательным. Нистатин помогает предотвратить рост плесени и других грибковых загрязнений на пластинах NGM. Большие пластины диаметром 150 мм имеют более высокую вероятность улавливания грибковых спор при снятии крышки для заливки и посева E. coli OP50. Нистатин можно приобрести предварительно смешанным в стерильном растворе у поставщиков по цене 10 000 единиц / мл или можно приобрести в виде стерильного порошка и смешать со стерильной водой. Нистатин не может быть автоклавирован, и он не может быть эффективно стерилизован. Внимание к асептической технике имеет решающее значение при смешивании раствора нистатина в лаборатории. Автоклав 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 и 1 M _MgSO4 при 121 °C в течение 15 мин. Фильтр стерилизует холестерин через фильтр 0,22 мкм после растворения в 95% этаноле.
5. После добавления реагентов в среду разлейте НГМ в сорок 150 мм чашки Петри. Для заполнения каждой тарелки размером 150 мм требуется 50 мл. Дайте пластинам NGM остыть в течение ночи при комнатной температуре.
6. Инокулируют две конические трубки по 50 мл, содержащие 25 мл стерильного LB, e. coli OP50 из предыдущей пластины полосы. Инкубируют бульон при 37 °C в течение 24 ч в встряхивающемся инкубаторе, поддерживаемом при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для консистенции инокулируйте обе трубки одной и той же одной колонией из пластины полосы. Если это окажется затруднительным, привите 5 мл стерильного LB одной колонией в конической трубке объемом 50 мл и инкубируйте культуру в течение 16 ч при 37 °C в встряхивающем инкубаторе, поддерживаемом при 200 об/мин за день до приготовления пластин NGM. Хранить свежую жидкую культуру при температуре 4 °C до двух дней. Инокулируют два 25 мл бульона 25 мкл жидкой культуры и инкубируют в тех же условиях, что и упомянутые выше.
7. Засыпьте свежие пластины NGM 1 мл свежей жидкой культуры E. coli OP50 и равномерно распределите пламенно стерилизованным распределителем по поверхности пластины, чтобы создать большой газон бактерий, который покрывает большую часть пластины, заботясь о том, чтобы не распространять бактерии от края до края. Дайте кишечной палочке OP50 расти при комнатной температуре в течение 72-96 ч или до появления заметно толстого газона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через 24 часа переместите свежепосеянные пластины NGM в закрытый контейнер, чтобы уменьшить потерю влаги и продлить срок службы пластин.

2. Синхронизация препаратов животных и отбеливателей

1. Перенесите 5 сытых, диких, гравидных взрослых C. elegans на каждую из 10 свежих пластин NGM, засеянных кишечной палочкой OP50, в общей сложности 50 животных.
2. Дайте животным отложить яйца. Пусть потомство растет при 20 °C, пока оно не достигнет стадии взрослой особи.
3. Используйте 15 мл буфера M9 (таблица 2) для сбора новых хорошо откормленных взрослых особей дикого типа с десяти опорных пластин и перенесите животных в меченую коническую трубку объемом 15 мл.
4. Центрифугировать животных по 1000 х г в течение 3 мин, чтобы гранулировать всех животных на дне трубки.
5. В отдельной, меченной конической трубкой объемом 15 мл смешайте 2 мл отбеливателя с 5 мл 1 N NaOH для синхронизации отбеливателя. Вихрь раствор тщательно перемешать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отбеливатель + раствор NaOH в тот же день, когда он подготовлен, чтобы быть эффективным.
6. Осторожно удалите супернатант из центрифугированных животных, используя стерильную пипетку объемом 10 мл. Попытайтесь удалить как можно больше буфера M9, чтобы улучшить разрушение животных.
7. Добавьте 500 мкл раствора отбеливателя + NaOH в гранулу животного и запустите таймер на 4 мин.
8. Либо вручную, либо с помощью коромысла аккуратно раскачивайте трубку, чтобы полностью сломать гранулу животного и позволить животным свободно двигаться в растворе отбеливателя + NaOH. Продолжайте раскачивать трубку в течение 4 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество отбеливателя + раствора NaOH может варьироваться в зависимости от размера синхронизируемой гранулы животного. Оптимизируйте эту технику заранее с помощью различных количеств животных и отбеливателя + раствора NaOH.
9. Через 4 мин проверьте эффективность разрушения под рассеченным микроскопом. Убедитесь, что большинство взрослых животных разбиты, а их внутреннее содержимое высвобождается, включая яйца.
10. Если животные не расколоты, ненадолго вихрьте трубку на максимальной скорости, затем проверьте еще раз под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя яйца устойчивы к отбеливателю + раствору NaOH, они не являются непроницаемыми. Яйца не должны подвергаться воздействию отбеливателя + раствора NaOH дольше, чем это необходимо. Слишком долгое сваливание во время этапа разрушения животного может привести к проблемам развития потомства.
11. Добавьте 10 мл буфера M9 в разбитый раствор животного.
12. Центрифугируйте яйца и остатки по 1000 х г в течение 3 мин.
13. Пипетка супернатанта прочь, следя за тем, чтобы не коснуться новой гранулы, содержащей все яйца на дне трубки.
14. Добавьте еще 10 мл буфера M9 и центрифугу снова в течение 3 минут при 1000 x g.
15. Повторите шаги 2.13-2.14 еще два раза, чтобы убедиться, что ни один из растворов отбеливателя + NaOH не останется.
16. После третьей промывки буфера M9 удалите надосадочный агент и добавьте 10 мл S-базального буфера (таблица 2).
17. Переверните трубку, чтобы разбить гранулу на дне, чтобы равномерно приостановить яйца в буфере.
18. Поместите трубку на коромысло и осторожно раскачивайте трубку в течение 22 ч при 20 °C, чтобы яйца вылупились и достигли личиночной стадии 1 (L1).
19. Через 22 ч центрифугируют трубку, содержащую синхронизированных животных L1, в течение 3 мин при 1000 х г.
20. Пипетку и выбросьте супернатант, оставив примерно 1 мл буфера в пробирке.
21. Используя микропипетку, потревожите гранулу животного, чтобы сделать однородную суспензию L1 животных в оставшемся буфере.
22. Переложите одну каплю однородной суспензии животных L1 на меченую 150 мм пластину NGM, засеянную кишечной палочкой OP50.
23. Рассчитайте плотность животных на каплю, визуально подсчитывая количество животных L1 на каплю с помощью рассеченного микроскопа. Плита NGM толщиной 150 мм с полностью выросшим газоном из кишечной палочки OP50 может поддерживать до 500 животных стадии L1, чтобы достичь взрослой стадии.
24. Перенесите животных L1 на шесть 150-мм пластин NGM с E. coli OP50. Следите за тем, чтобы не перегружать пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если неясно, будет ли у животных достаточно пищи для развития между L1 и взрослой особью, добавьте меньше животных в каждую тарелку и используйте больше тарелок.
25. Дайте животным расти в течение 72 ч при 20 °C, пока они не достигнут стадии взрослой особи и не начнут откладывать яйца.
26. Выполните второй раунд синхронизации отбеливателя на синхронизированных, хорошо сытых взрослых животных дикого типа.
27. Поместите синхронизированных животных L1 на десять 150-мм пластин NGM, засеянных E. coli OP50, с примерно 1000 животными на пластину.
28. Позвольте новым синхронизированным животным L1 расти в течение 48 ч при 20 °C, пока они не достигнут стадии L4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы получить приблизительно 700 - 800 мкл гранулы L4 животных. Слишком много животных может затруднить использование гомогенизатора Balch; это может привести к напряжению мышц при работе гомогенизатора и возможной утечке из шприцев из-за повышенного давления.

3. Подготовка гомогенизатора Балха

1. Подготовьте как гипотонические, так и гипертонические буферы, как указано в таблице 3 и таблице 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гипотонические и гипертонические буферы могут быть приготовлены заранее и безопасно храниться при температуре 4 °C.
2. Очистите гомогенизатор Balch, затопив камеру измельчения 70% этанолом, затем промойте камеру деионизированной водой, чтобы удалить избыток этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования любых едких агентов для очистки гомогенизатора Balch. Тщательного ополаскивания этанолом и деионизированной водой должно быть достаточно для его очистки.
3. Вставьте шарик из карбида вольфрама диаметром 7,9820 мм (зазор 18 мкм) в шлифовальную камеру.
4. Закройте каждый конец ствола гомогенизатора Balch и закрепите колпачки с помощью прилагаемых винтов.
5. Приготовьте 5 мл «полного гипотонического буфера» на образец: добавьте 5 мкл 1 М DTT (конечная концентрация: 1 мМ DTT) и 100 мкл 100-кратного ингибитора протеазы, одноразовый коктейль (конечная концентрация: 2x). Держите буфер на льду.
6. Приготовьте 5 мл «полного гипертонического буфера» на образец: добавьте 5 мкл 1 М DTT (конечная концентрация: 1 мМ DTT) и 100 мкл 100-кратного ингибитора протеазы, одноразовый коктейль (конечная концентрация: 2x). Держите буфер на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полный гипотонический и гипертонический буфер в один и тот же день приготовления. Не храните его для последующего использования. Хранить 1 M DTT в виде одноразовых аликвот при -20 °C. Хранить ингибитор протеазы одноразовый коктейль при 4 °C.
7. Наполните стерильный шприц объемом 2 мл 1 мл «полного гипотонического буфера» и осторожно промывайте шлифовальную камеру гомогенизатора Balch. Оставьте примерно 500 мкл «полного гипотонического буфера» в камере.
8. Вымойте промытый гомогенизатор на льду и дайте ему остыть в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизатор должен быть ледяным перед измельчением животных. Процесс измельчения может производить тепло из-за трения и денатурировать ядерные белки. Убедитесь, что гомогенизатор металла ледяной, чтобы предотвратить это. Обязательно избегайте попадания воды из окружающего льда в гомогенизатор. Используйте два стерильных шприца, чтобы заткнуть отверстия в гомогенизаторе и заблокировать попадание любых непреднамеренных жидкостей в шлифовальную камеру.

4. Коллекция животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Приводится краткое справочное руководство, в котором обозначены основные этапы сбора, разрушения и фракционирования животных (рисунок 1).

1. Соберите сытых животных L4 с буфером M9 в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугируйте животных при 1000 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант и продолжайте мыть гранулу животного до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.
2. Промыть животных 3 мл гипотонического буфера 4 °C и снова центрифугировать при 1000 х г в течение 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время заключительной промывки с гипотоническим буфером 4 °C животные могут прилипать к боковой части трубки. Это нормально и может привести к небольшой потере животных во время удаления супернатанта.
3. Удалите гипотонический буфер и добавьте 1 мл «полного гипотонического буфера» к грануле животного. Переведите суспензию животного на новый стерильный шприц объемом 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе животных в шприц с помощью микропипетки аккуратно пипетку аккуратно нанесите стерильный 0,1% раствор Tween20, чтобы покрыть внутреннюю часть кончика пипетки, чтобы уменьшить количество животных, потерянных из-за прилипания к стенкам наконечника пипетки.

5. Фракционирование

1. На льду гомогенизируйте животных, осторожно проталкивая животных через шлифовальную камеру гомогенизатора Balch, загруженного шаром 7,9820 мм, и в новый стерильный шприц. Повторите проталкивание животных через шлифовальную камеру в течение 30 полных циклов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: "Полный цикл" определяется как полное движение плунжера шприца вверх и вниз.
   На этом этапе шлифования используется шарик 7,9820 мм (шарикоподшипник 18 мкм).
2. После 30 циклов удалите как можно больше суспензии животного из гомогенизатора Balch и сохраните шприц, опрокинув его в микропробирке объемом 1,7 мл.
3. Извлеките шарик размером 7,9820 мм из шлифовальной камеры и очистите его деионизированной водой. Высушите и верните шарик в маркированную трубку.
4. Вставьте шарик диаметром 7,9880 мм (зазор 12 мкм) в шлифовальную камеру и повторно запечатайте гомогенизатор.
5. Снова промыть камеру измельчения 1 мл ледяного «полного гипотонического буфера».
6. Шлифуйте суспензию в течение 25 полных циклов.
7. После 25 циклов извлеките суспензию животного из гомогенизатора Balch, перенесите суспензию в чистую микропробирку объемом 1,7 мл и храните ее на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разберите и очистите гомогенизатор Balch с 70% этанолом и деионизированной водой. Обязательно верните шарик диаметром 7,9880 мм в соответствующую трубку.
8. Гранулируют тела животных и мусор путем центрифугирования суспензии при 500 х г, 4 °C в течение 5 мин.
9. Пипетка 40 мкл супернатанта в трубку с надписью «входная фракция» и храните ее на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите все этикетки спиртостойкой ручкой, чтобы не размазывать их позже.
10. Перенесите оставшийся супернатант в новую трубку объемом 1,7 мл, стараясь не касаться гранулы в нижней части трубки, а затем выбросьте гранулу.
11. Центрифугируйте супернатант для гранулирования ядер при 4000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
12. Перенесите надосадочный агент, чтобы не нарушить гранулированные ядра, в новую трубку объемом 1,7 мл и пометьте трубку как «цитозольную фракцию».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугируйте цитозольную фракцию дополнительно при 17 000 х г, 4 °C в течение 30 мин, чтобы удалить любой оставшийся нерастворимый материал, и используйте его в качестве отрицательного контроля для западных блотов (особенно для ядерных белков).
13. Вымойте гранулу ядер 500 мкл «полного гипотонического буфера» и переложите гранулу в новую трубку объемом 1,7 мл. Центрифугировать суспендированную гранулу при 4,000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
14. Выбросьте супернатант и добавьте 500 мкл свежего «полного гипотонического буфера» в ядерную гранулу и перенесите суспензию в новую трубку объемом 1,7 мл. Снова центрифугируйте образец при 4 000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
15. Удалите супернатант и растворите гранулу в 40 мкл «полного гипертонического буфера». Перенесите новую ядерную суспензию в новую трубку объемом 1,7 мл, пометьте трубку как «ядерную фракцию» и храните ее на льду.
16. Определите концентрацию белка в трех фракциях с помощью флуоресцентного набора для количественной оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ядерного белка, полученного с помощью этого метода, может составлять от 1 до 2 мкг/мкл.
17. Аликвотирование ядерных фракций в одноразовые трубки, содержащие 6 мкг ядерного белка, и мгновенная заморозка в ванне с сухим льдом и этанолом. Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

6. Транскрипционный анализ

1. Включите и разогрейте тепловой блок до 30 °C.
2. Удалите из системы транскрипции Nulcear Extract in vitro следующее: 50 мМ _MgCl2, ядерный экстракт 1x транскрипционный буфер, 100 мМ rATP, 100 мМ rCTP, 100 мМ rGTP, 100 мМ rUTP и шаблон положительного контроля промотора CMV. Оттаивание на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Амплифицируйте шаблон ДНК с положительным контролем с помощью высокоточной полимеразы и храните его в виде нормализованных одноразовых аликвот.
3. Смешайте и центрифугируйте размороженные РНКТП перед приготовлением рабочего раствора емкостью 10 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 2 мкл каждого rATP, rCTP, rGTP и rUTP к 12 мкл _H2O для достижения 10 мМ каждого rNTP. При необходимости этот состав можно масштабировать.
4. Aliquot смесь rNTP к маркированным одноразовым трубкам и храните при -20 °C для будущего использования.
5. В свежую пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой «Mastermix» добавляют реагенты для каждой реакции, как указано в таблице 5
6. Перенос 14 мкл Mastermix в каждую реакционную трубку
7. Добавьте 11 мкл минус (объем на 5 мкг ядерного экстракта) 1x транскрипционного буфера к каждой реакционной трубке.
8. Добавьте 5 мкг ядерного экстракта в каждую реакционную трубку.
9. Осторожно постучите по реакционной трубке, чтобы перемешать содержимое внутри и импульсно центрифугировать трубки после смешивания, чтобы убедиться, что реакционный материал не прилипает к стенке трубок.
10. Инкубируют реакции при 30 °C в течение 30 мин.
11. Немедленно остановите реакцию, добавив 400 мкл буфера RLT, обеспечиваемого набором для экстракции РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе безопасно остановиться. Образцы могут храниться при -80 °C до дальнейшей очистки с помощью набора для экстракции РНК.

7. Очистка РНК

1. Подготовьте раствор DNNase I, используя набор DNAse без РНКазы, поставляемый в комплекте для экстракции РНК. Растворить лиофилизированную ДНКазу I в 550 мкл воды, не содержащей РНКазы. Аккуратно перемешайте раствор. Не вихрь. Аликвотировать раствор ДНКазы I в одноразовые пробирки по 10 мкл и хранить аликвоты при -20 °С.
2. Приготовьте 70% и 80% этанола, используя молекулярный этанол и воду без РНКазы.
3. Перед началом очистки переместите образцы и реагенты в рабочее пространство, свободное от RNase.
4. Добавьте 400 мкл 70% этанола к каждому образцу и аккуратно перемешайте пипетку, чтобы хорошо перемешать.
5. Перенесите 400 мкл образца в меченую спиновую колонну экстракции РНК с трубкой для сбора 2 мл и центрифугируйте образец при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
6. Повторите шаг 7.5 с оставшимся образцом и отбросьте поток.
7. Добавьте 350 мкл буфера RW1 (набор для экстракции РНК) в каждую колонку. Центрифугирование колонн при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
8. Добавьте 70 мкл буфера RDD (набор для экстракции РНК) к одной аликвоте 10 мкл раствора ДНКазы I и аккуратно перемешайте. Не вихрь.
9. Добавьте инкубационную смесь ДНКазы I (80 мкл) непосредственно к мембране спиновой колонки. Инкубировать колонны при комнатной температуре в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте раствор ДНКазы I к мембране. Избегайте потери части раствора на стенке колонны или уплотнительном кольце.
10. Через 15 минут добавьте 350 мкл буфера RW1 в столбцы. Центрифуга на 30 с при 8 500 х г. Отбросьте сквозной поток.
11. Поместите колонны в новые коллекторные трубки по 2 мл. Добавьте 500 мкл буфера RPE (комплект для экстракции РНК) в спиновую колонку. Центрифугируйте колонны при 8 500 х г в течение 30 с для промывки мембраны. Отбросьте сквозной поток.
12. Добавьте 500 мкл 80% этанола в каждую колонку и центрифугируйте колонки при 8 500 х г в течение 30 с. Отбросьте сквозной поток.
13. Поместите колонны в новые коллекторные трубки по 2 мл. Оставив крышки колонн открытыми, центрифугируйте колонны при 17 900 х г в течение 5 мин. Отбросьте сквозной поток.
14. Поместите колонны в маркированные трубки объемом 1,7 мл. Добавьте 17 мкл рваной воды непосредственно в центр мембраны спиновой колонны. Дайте колонкам отдохнуть при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифугирование колонн при 17 900 х г в течение 1 мин.
15. Отбросьте колонку и сохраните пробирку объемом 1,7 мл со свежеочищенным образцом РНК.

8. Переваривание ДНК

1. Разогрейте два тепловых блока при 37 °C и 65 °C.
2. Добавьте 2 мкл 10-кратного реакционного буфера к каждому образцу.
3. Добавьте 1 мкл (1 MBU) ДНКазы к каждому образцу.
4. Установите пипетку на 10 мкл и пипеткой новый раствор вверх и вниз аккуратно перемешайте. Не вихрь.
5. Инкубируйте образцы РНК при 37 °C в течение 30 минут, чтобы переварить оставшуюся ДНК.
6. Инактивируют ДНКазу путем инкубации образцов на тепловом блоке при 65 °C в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасно остановиться на этом этапе и сохранить РНК при -80 °C, чтобы выполнить обратную транскрипцию позже.

9. Обратная транскрипция

1. При программировании термоциклера добавьте дополнительный шаг 1 ч, 37 °C перед инкубацией, чтобы предварительно нагреть термоциклер. Запустите программу с «шагом предварительного нагрева» во время подготовки образцов и дайте термоциклеру достичь 37 °C. Когда образцы для обратной транскрипции будут готовы, пропустите стадию предварительного нагрева 37 °C и перейдите к фактической стадии инкубации (таблица 6). Если термоциклер не имеет функции пропуска, добавьте шаг 1 мин 37 °C перед инкубацией. Дайте термоциклеру нагреться до надлежащей температуры, прежде чем приостанавливать систему и добавлять подготовленные образцы.
2. Подготовьте рабочий раствор транскрипционного реверсивного праймера 10 мкМ в _H2O без РНКазы и храните его на льду.
3. Оттаивание на льду, 10-кратный буфер из набора обратной транскрипции, смесь dNTP (5 мМ каждый dNTP), ингибитор РНКазы и обратная транскриптаза.
4. Приготовьте Mastermix (на реакцию), добавив компоненты, указанные в таблице 7 , в чистую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
5. Aliquot 18 мкл Mastermix в новые 0,2 мл ПЦР-пробирки для каждого образца.
6. Добавьте 2 мкл обработанной ДНКазой РНК для каждого образца в их соответственно меченые пробирки.
7. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 1 ч в предварительно нагретом термоциклере.
8. Переместите образцы до -20 °C для хранения после обратной транскрипции или перейдите непосредственно к следующему шагу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге безопасно остановиться; хранить кДНК при -20 °C для последующего использования.

10. Удельное усиление продукта

1. Оттаивание на льду: кДНК, транскрипция 10 мкМ вперед и 10 мкМ транскрипция обратных праймеров, а также ПЦР 2x премикс А.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquot PCR 2x Premix A в меньшие объемы, чтобы уменьшить время оттаивания.
2. Создайте Mastermix (на реакцию), добавив компоненты, упомянутые в таблице 8 , в чистую ПЦР-трубку объемом 0,2 мл.
3. Aliquot 24 мкл Mastermix для каждого образца в чистые маркированные 0,2 мл ПЦР-пробирки.
4. Добавьте 1 мкл кДНК каждого образца в соответствующие пробирки.
5. Инкубация образцов в термоциклере с использованием программных условий, указанных в таблице 9
6. После инкубации храните продукты ПЦР при 4 °C или -20 °C для более длительного хранения.

11. Анализ геля

1. Используйте 1x TAE буфер для приготовления геля, который содержит 2% мас./об.агарозы и 1x гелевое пятно.
2. Запускайте продукты ПЦР при 50 В и 300 мА в течение 1 ч или до тех пор, пока не произойдет четкое разделение полос.
3. Визуализируйте гель с помощью автоматизированной программы экспозиции, предварительно загруженной в гель-тепловизор.

Representative Results

Следуя описанным шагам, следует получить функциональный ядерный экстракт (рисунок 1), отклонение на этапах измельчения или промывки может привести к плохой активности или низкому выходу. Если получен функциональный ядерный экстракт C. elegans , он будет транскрибировать область ниже по течению от промотора ЦМВ на шаблоне ДНК при добавлении к ранее описанному анализу in vitro . Полученный транскрипт РНК может быть очищен от ядерных белков и шаблона ДНК с использованием обычных методов. Без шаблона ДНК обратная транскрипция и последующий продукт ПЦР могут быть только результатом РНК, транскрибируемой ядерным экстрактом. Продукты ПЦР могут быть визуализированы на агарозном геле, интенсивность полосы ДНК может свидетельствовать о качестве ядерного белка и выделения РНК. Слабая интенсивность полосы может быть вызвана инактивацией ядерного экстракта либо теплом, либо плохой подготовкой буфера. Чрезмерно сильная интенсивность полосы может быть результатом загрязнения ДНК либо из-за плохой очистки РНК, либо из-за неправильного переваривания ДНКазы. Последовательные и успешные ядерные изоляции будут производить полосы одинаковой интенсивности, и как транскрипционный, так и отрицательный контроль ПЦР не должны иметь видимого продукта ПЦР (рисунок 2).

Рисунок 1. Контур изоляции ядерного экстракта. На блок-схеме изложены основные шаги по выделению ядерного экстракта из C. elegans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Ядерный экстракт C. elegans сохраняет свою активность. На изображении геля показаны продукты транскрипции ядерного экстракта личинок C. elegans L4 с использованием шаблона ДНК промотора ЦМВ. Успешное выделение активных ядерных белков приведет к получению ПЦР-продукта 132 bp после транскрипции in vitro , как показано на полосах 1 и 2. Неудачная изоляция приведет к слабой полосе или отсутствию продукта ПЦР, аналогичного полосе 3. Эта визуализация транскрипционной активности с помощью амплификации ПЦР является простым способом оценки качества изоляции ядерной экстракции. Положительный контроль ПЦР производится путем добавления шаблона ДНК промотора ЦМВ к реакции ПЦР, а отрицательному контролю не хватает днк шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Пластины среды для роста нематод
Агар	20.4 г
Хлорид натрия	2.8 г
Бакто пептон	2.3 г
дН2О	975 мл
Автоклав при 121 °C в течение 30 мин
Дайте среде остыть до 50 °C, прежде чем добавлять следующее:
1 м CaCl2 (стерильный)	1 мл
1 M MgSO4 (Стерильный)	1 мл
10 000 шт/мл нистатина (стерильный)	3 мл
5 мг/мл холестерина в 95% этаноле (стерилизованный фильтр)	1 мл
1M KPO4 pH 6.0 (Стерильный)	25 мл

Таблица 1.

Буфер M9
Х2ПО4	3 г
На2ХПО4	6 г
НаКл	5 г
дН2О	1 000 мл
Автоклав при 121 °C в течение 15 мин
1 M MgSO4 (Стерильный)	1 мл (добавить после автоклавирования)
S-базальный буфер
Х2ПО4	6 г
К2ХПО4	1 г
НаКл	5,85 г
дН2О	1 000 мл
Автоклав при 121 °C в течение 15 мин
Холестерин 5 мг/мл (стерильный)	1 мл (добавить после автоклавирования)

Таблица 2.

Гипотонический буфер
Складское решение	Том	Конечная концентрация
1 М HEPES KOH pH 7,6	7,5 мл	15 мМ
1 млн кКл	5.0 мл	10 мМ
1 М МгCl2	2,5 мл	5 мМ
0,5 МЛН ЭДТА	0.1 мл	0.1 мМ
1 М Сахароза	175 мл	350 мМ
дН2О	309.9 мл
Фильтр стерилизуется

Таблица 3.

Гипертонический буфер
Складское решение	Том	Конечная концентрация
1 М HEPES KOH pH 7,6	7,5 мл	15 мМ
1 млн кКл	200 мл	400 мМ
1 М МгCl2	2,5 мл	5 мМ
0,5 МЛН ЭДТА	0.1 мл	0.1 мМ
10% анимация движения 20	5 мл	0.10%
50% глицерина	100 мл	10%
дН2О	184.9 мл
Фильтр стерилизуется

Таблица 4.

MgCl2, 50 мМ	1.5 мкл
смесь rNTP, 10 мМ каждая	1.0 мкл
ДНК шаблона, 25 нг/мкл	4.0 мкл
H2O без РНКазы	7.5 мкл

Таблица 5.

Шаг	Темп	Время	Номер цикла
Предварительно нагревать	37 °С	60 мин	в 1 раз
Обратная транскрипция	37 °С	60 мин	в 1 раз
Держать	10 °С		в 1 раз

Таблица 6.

10x буфер обратной транскрипции	2.0 мкл
dNTP Mix (5 мМ каждый dNTP)	2.0 мкл
Транскрипционный обратный букварь (10 мкМ)	2.0 мкл
Ингибитор РНКАЗЫ	1.0 мкл
Обратная транскриптаза Sensiscript	1.0 мкл
H2O без РНКазы	10.0 мкл

Таблица 7.

H2O без РНКазы	6.25 мкл
Транскрипционный букварь (10 мкМ)	2.5 мкл
Транскрипционный обратный букварь (10 мкМ)	2.5 мкл
ПЦР 2X Премикс А	12.5 мкл
Смесь ферментов ПЦР	0.25 мкл

Таблица 8.

Шаг	Темп	Время	Номер цикла
Начальная денатура	92 °С	60 с	в 1 раз
Денатурировать	92 °С	30 с
Отжигать	59 °С	30 с	в 35 раз
Расширение	72 °С	30 с
Держать	10 °С		в 1 раз

Таблица 9.

Discussion

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. elegans. Хотя этот протокол был сосредоточен на визуализации транскрипционной активности, кДНК, полученная посттранскрипционно, может быть количественно определена с использованием RT-qPCR для получения более точного измерения активности транскрипции8. Этот метод выделения ядерных белков из C. elegans может помочь расширить изучение механизма эукариотической транскрипции. Поскольку C. elegans не является культурой клеток в чашке или колонией дрожжей, а скорее свободно бродящим животным, выделение и исследование его ядерного экстракта может дать более четкое представление о том, как транскрипционный механизм может меняться со временем или в различных средах. Это позволяет исследователям воспользоваться преимуществами низкой стоимости и устойчивости C. elegans. C. elegans, в отличие от других модельных организмов или клеточных культур, гораздо более снисходителен, когда появляется бактериальное или дрожжевое загрязнение. Популяция C. elegans может быть легко очищена от загрязнения с использованием установленных протоколов, экономя время и усилия, когда загрязнение ^{происходит9}. В целом, использование ядерного экстракта из C. elegans для биохимических анализов может быть более доступным и гибким вариантом по сравнению с покупкой ядерного экстракта у поставщика или работой с менее снисходительными модельными организмами.

Хотя этот протокол относительно прост, все еще существуют критические шаги, которые требуют особого внимания для успешной изоляции ядерного экстракта. Важно, чтобы во время приготовления полного гипотонического и гипертонического буферов два раствора были четко обозначены и разделены. Если буферы переключаются в любой момент во время изоляции, это может привести к инактивации ядерных белков или плохому фракционированию цитозольных белков из ядерных белков. Изолированные ядерные белки также следует при необходимости разбавлять в гипертоническом буфере, а не в воде или любом другом растворе. Высокая концентрация соли помогает сохранить активность белков, а гипотонический раствор может убить эту ^{активность10}.

Еще одна проблема, которая может возникнуть во время шлифовальной части этого протокола, связана с мусором, прилипшим к поверхности вольфрамовых шариков. Хотя указано, что шарики должны быть вымыты и высушены после каждого цикла шлифования, материал будет прикрепляться к гладкой поверхности шариков. Этот материал обычно выглядит в виде ржавых колец по окружности шаров и достаточно толстый, чтобы блокировать зазор между шаром и стенкой шлифовальной камеры. Эта блокировка заметна, так как становится все труднее и труднее протолкнуть животных через мясорубку, что в конечном итоге может привести к мышечной травме или разрыву шприца. Если вольфрамовые шарики начинают проявлять обесцвечивание, замочите их в горячей воде на 5 минут, затем очистите поверхность новой прокладкой для чистки. Избегайте использования кислотных или основных чистящих растворов. После аккуратной полировки вольфрамовые шарики должны вернуть себе первоначальный блеск, и измельчать образцы будет заметно легче.

Этот протокол предназначен для выделения целого ядерного экстракта из C. elegans. Он не был протестирован для использования на других модельных организмах. Ядерный экстракт из других организмов может потребовать различных буферов, и промотора ЦМВ может быть недостаточно для управления транскрипцией в других образцах, не относящихся к млекопитающим. Ядерный экстракт, собранный с помощью этого метода, также не является тканевым или клеточно-специфическим; любая транскрипционная активность, измеренная с помощью этого метода, рассматривает животных в целом, что может скрывать тонкие изменения между тканями.

Будущее использование этого протокола может заключаться в измерении механизма репарации или репликации ДНК C. elegans после повреждения ДНК. Цитозольная фракция, собранная в процессе выделения, может быть использована для измерения количества растворимых белков и количественной оценки активности этих белков способом, аналогичным измерению транскрипции.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010