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Biochemistry

सक्रिय Caenorhabditis elegans परमाणु निकालें और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62723
Automatic Translation
1, 1
1Department of Translational Medicine and Physiology, Elson S. Floyd College of Medicine, Washington State University

Summary

यहां, हम लार्वा चरण 4 सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

Caenorhabditis elegans जैविक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली रही है क्योंकि इसे 1963 में पेश किया गया था। हालांकि, सी एलिगन्स को अपने परमाणु अर्क जैसे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और डीएनए प्रतिकृति का उपयोग करके जैविक प्रतिक्रियाओं के जैव रासायनिक अध्ययन में पूरी तरह से उपयोग नहीं किया गया है। जैव रासायनिक अध्ययन में सी एलिगन्स का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा परमाणु अर्क की गतिविधि का त्याग किए बिना नेमाटोड के मोटे बाहरी छल्ली को बाधित कर रही है। जबकि छल्ली को तोड़ने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे कि डॉन्स होमोजेनाइजेशन या sonication, वे अक्सर प्रोटीन अस्थिरता का कारण बनते हैं। इन विट्रो प्रतिक्रियाओं के लिए लार्वा या वयस्क सी एलिगन्स से सक्रिय परमाणु प्रोटीन को अलग करने के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल नहीं हैं। यहां, प्रोटोकॉल विस्तार से लार्वा चरण 4 सी elegans के homogenization एक Balch homogenizer का उपयोग कर वर्णन करता है. Balch homogenizer इस प्रक्रिया में छल्ली को तोड़ने वाले एक संकीर्ण अंतराल के माध्यम से जानवरों को धीरे-धीरे मजबूर करने के लिए दबाव का उपयोग करता है। बाल्च homogenizer के वर्दी डिजाइन और सटीक मशीनिंग प्रयोगों के बीच जानवरों के लगातार पीसने के लिए अनुमति देते हैं। Balch homogenizer से प्राप्त homogenate fractionating कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु निकालने है कि C. elegans के प्रतिलेखन गतिविधि assaying के लिए एक इन विट्रो विधि में इस्तेमाल किया जा सकता है पैदावार.

Introduction

छोटे, मुक्त रहने वाले नेमाटोड Caenorhabditis elegans जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली मॉडल जीव है। 1963 में इसकी शुरुआत के बाद से, नेमाटोड न्यूरोबायोलॉजी, चयापचय, उम्र बढ़ने, विकास, प्रतिरक्षा और आनुवंशिकी में सवालों के जवाब देने के लिए अमूल्य रहे हैं। जानवर की कई विशेषताओं में से कुछ जो इसे एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं, उनमें छोटी पीढ़ी का समय, आरएनए हस्तक्षेप की प्रभावशीलता, पारदर्शी शरीर और इसके सेलुलर वंश और तंत्रिका तंत्र दोनों के पूर्ण नक्शे शामिल हैं।

जबकि विज्ञान में सूत्रकृमि का योगदान विशाल है, उन्हें यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली को स्पष्ट करने के लिए कम उपयोग किया गया है, इन तंत्रों के बारे में हमारी अधिकांश समझ खमीर, फल मक्खी और स्तनधारी सेल कल्चर 2 से परमाणु अर्क का उपयोग करके अध्ययन से आ रही है। सबसे बड़ी बाधा जो शोधकर्ताओं को कार्यात्मक परमाणु अर्क निकालने से रोकती है, वह नेमाटोड की कठिन बाहरी छल्ली है। इस एक्सोस्केलेटन में क्रॉस-लिंक्ड कोलेजन, क्यूटिकलिन, ग्लाइकोप्रोटीन और लिपिड शामिल हैं, जिससे लार्वा चरण से वयस्कता तक सी एलिगेंस रासायनिक या यांत्रिक बलों के माध्यम से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रतिरोधी हो जाते हैं3। C. elegans परमाणु निकालने का उपयोग करके एक इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम एक बार विकसित किया गया था, लेकिन सिस्टम के सीमित दायरे के कारण व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया था, और अर्क तैयार करने के लिए Dounce homogenizer का उपयोग प्रोटीन अस्थिरता 4,5 को जन्म दे सकता है।

परमाणु निकालने अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, जिसने C. elegans को तोड़ने के लिए एक Dounce homogenizer का उपयोग किया, यह प्रोटोकॉल एक Balch homogenizer का उपयोग करता है। Balch homogenizer में दो मुख्य घटक होते हैं: एक टंगस्टन कार्बाइड बॉल और एक स्टेनलेस-स्टील ब्लॉक जिसमें एक चैनल एक छोर से दूसरे छोर तक ऊब जाता है। Balch homogenizer टंगस्टन कार्बाइड गेंद के साथ भरी हुई है और पीसने कक्ष सील करने के लिए दोनों तरफ से छाया हुआ है। सिरिंज को पीसने वाले कक्ष में अग्रणी दो ऊर्ध्वाधर बंदरगाहों पर लोड किया जा सकता है। जैसा कि सामग्री को पीसने वाले कक्ष के माध्यम से एक सिरिंज से दूसरे में पारित किया जाता है, सिरिंज से दबाव गेंद और कक्ष की दीवार के बीच एक संकीर्ण अंतर के माध्यम से सामग्री को मजबूर करता है। यह धीमा और निरंतर दबाव सामग्री को तब तक तोड़ता है जब तक कि यह एक सुसंगत आकार तक नहीं पहुंच जाता है जो आसानी से संकीर्ण अंतराल से गुजरने में सक्षम होता है। एक निरंतर अभी तक कोमल दबाव के माध्यम से संकीर्ण अंतर के माध्यम से सी elegans मजबूर जानवरों को खुला तोड़ता है, आसपास के बफर में अपनी सामग्री जारी करता है। गेंद के आकार को स्विच करना अंतर को और कड़ा करता है, नई जारी कोशिकाओं को तोड़ता है और नाभिक को बफर में मुक्त करता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के कई उदाहरण नाभिक को सेल मलबे के बाकी हिस्सों से अलग करते हैं, जिससे एक स्वच्छ परमाणु अर्क के संग्रह की अनुमति मिलती है। बाल्च होमोजेनाइज़र को कई कारणों से डौंस होमोजेनाइज़र पर पसंद किया जाता है: सिस्टम बड़ी संख्या में जानवरों को संभाल सकता है, जिससे एक ही प्रयास में सक्रिय प्रोटीन की उच्च मात्रा को निकालना संभव हो जाता है; गेंदों और स्टील ब्लॉक की सटीक मशीनिंग कई नमूनों के बीच लगातार पीसने के लिए अनुमति देता है; भारी स्टील ब्लॉक एक गर्मी सिंक के रूप में कार्य करता है, समान रूप से पीसने वाले कक्ष से दूर गर्मी खींचता है, विकृतीकरण को रोकता है।

अलगाव के बाद, परमाणु निकालने ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को किसी भी जैव रासायनिक प्रयोगों में उपयोग किए जाने से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए। परंपरागत रूप से, प्रतिलेखन गतिविधि को नए संश्लेषित आरएनए को ट्रैक करने और कल्पना करने के लिए रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके मापा गया था। हालांकि, रेडियोधर्मी लेबलिंग बोझिल हो सकती है क्योंकि इसके लिए उपयोग और निपटान के दौरान सावधानी की आवश्यकता होती है6। तकनीकी प्रगति आज शोधकर्ताओं को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) जैसी तकनीकों का उपयोग करके छोटी आरएनए मात्रा को मापने के लिए बहुत कम हानिकारक या परेशानी वाले तरीकों का उपयोग करने की अनुमति देती है। यहां, प्रोटोकॉल लार्वा चरण 4 (एल 4) सी एलिगेंस से सक्रिय परमाणु अर्क को अलग करने और इन विट्रो सिस्टम में प्रतिलेखन गतिविधि की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

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Protocol

1. मीडिया की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए बाँझ लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) आगर प्लेटों और तरल मीडिया तैयार करें।
  2. लकीर Escherichia कोलाई (ई कोलाई) एक एलबी आगर प्लेट पर तनाव OP50. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया की लकीर को इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर ई कोलाई OP50 लकीर प्लेट स्टोर करें। ई कोलाई OP50 प्लेट सुरक्षित रूप से 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि नमी के नुकसान को रोकने के लिए पैराफिल्म में लपेटा जाता है।
  4. तालिका 1 में नुस्खा का उपयोग करके नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) के 2 एल तैयार करें।
    नोट: Nystatin वैकल्पिक है। Nystatin मोल्ड को रोकने में मदद करता है, और अन्य कवक एनजीएम प्लेटों पर बढ़ने से दूषित होते हैं। बड़े 150 मिमी व्यास की प्लेटों में फंगल बीजाणुओं को पकड़ने की अधिक संभावना होती है जब ढक्कन डालने और ई कोलाई OP50 को बोने के लिए हटा दिया जाता है। Nystatin 10,000 इकाइयों / mL पर विक्रेताओं से बाँझ समाधान में premixed खरीदा जा सकता है या एक बाँझ पाउडर के रूप में खरीदा जा सकता है और बाँझ पानी के साथ मिश्रित किया जा सकता है। Nystatin autoclaved नहीं किया जा सकता है, और न ही इसे प्रभावी ढंग से फ़िल्टर किया जा सकता है sterilized. प्रयोगशाला में nystatin के एक समाधान मिश्रण करते समय एसेप्टिक तकनीक पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। आटोक्लेव 1 M CaCl2, 1 M KPO4 pH 6.0, और 1 M MgSO4 15 मिनट के लिए 121 °C पर। फ़िल्टर 95% इथेनॉल में भंग होने के बाद एक 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल sterilize.
  5. मीडिया में अभिकर्मकों को जोड़ने के बाद, चालीस 150 मिमी पेट्री व्यंजनों में एनजीएम डालें। प्रत्येक 150 मिमी डिश को भरने के लिए 50 एमएल की आवश्यकता होती है। एनजीएम प्लेटों को कमरे के तापमान पर रात भर ठंडा होने दें।
  6. पिछले लकीर प्लेट से ई कोलाई OP50 के साथ बाँझ एलबी के 25 मिलीलीटर युक्त दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को संक्रमित करें। 200 आरपीएम पर बनाए रखा एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शोरबा इनक्यूबेट करें।
    नोट: स्थिरता के लिए, लकीर प्लेट से एक ही एकल कॉलोनी के साथ दोनों ट्यूबों को टीका लगाएं। यदि यह मुश्किल साबित होता है, तो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक एकल कॉलोनी के साथ बाँझ एलबी के 5 मिलीलीटर को टीका लगाएं और एनजीएम प्लेटों को तैयार करने से पहले दिन में 200 आरपीएम पर बनाए रखे गए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें। ताजा तरल संस्कृति को दो दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तरल संस्कृति के 25 μL के साथ शोरबा के दो 25 मिलीलीटर को संक्रमित करें और ऊपर उल्लिखित समान परिस्थितियों में इनक्यूबेट करें।
  7. ताजा ई कोलाई OP50 तरल संस्कृति के 1 मिलीलीटर के साथ बीज ताजा NGM प्लेटों और एक लौ sterilized स्प्रेडर के साथ समान रूप से प्लेट की सतह पर समान रूप से फैल एक बड़े बैक्टीरिया लॉन है कि प्लेट के बहुमत को कवर बनाने के लिए, ध्यान रखने के लिए किनारे से किनारे तक बैक्टीरिया फैलाने के लिए नहीं ले जा रहा है। ई कोलाई OP50 को कमरे के तापमान पर 72-96 घंटे के लिए या जब तक एक स्पष्ट रूप से मोटा लॉन दिखाई नहीं देता है, तब तक बढ़ने की अनुमति दें।
    नोट: 24 घंटे के बाद, नमी के नुकसान को कम करने और प्लेटों के जीवन का विस्तार करने के लिए एक कवर कंटेनर में ताजा बीज वाले एनजीएम प्लेटों को स्थानांतरित करें।

2. पशु तैयारी और ब्लीच सिंक्रनाइज़ेशन

  1. कुल 50 जानवरों के लिए ई कोलाई OP50 के साथ सीड किए गए 10 ताजा एनजीएम प्लेटों में से प्रत्येक के लिए 5 अच्छी तरह से खिलाया, जंगली-प्रकार, गुरुत्वाकर्षण वयस्क सी. एलिगन्स को स्थानांतरित करें।
  2. जानवरों को अंडे देने की अनुमति दें। संतानों को 20 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें जब तक कि वे गुरुत्वाकर्षण वयस्क चरण तक नहीं पहुंच जाते।
  3. M9 बफर (तालिका 2) के 15 मिलीलीटर का उपयोग करें नए अच्छी तरह से खिलाया जंगली प्रकार, दस रखरखाव प्लेटों से गुरुत्वाकर्षण वयस्कों को इकट्ठा करने और जानवरों को एक लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए।
  4. ट्यूब के तल पर सभी जानवरों को गोली मारने के लिए 3 मिनट के लिए 1,000 x g पर जानवरों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. एक अलग, लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, ब्लीच सिंक्रनाइज़ेशन के लिए 1 एन एनएओएच के 5 एमएल के साथ ब्लीच के 2 एमएल मिश्रण करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए घोल भंवर.
    नोट: ब्लीच + NaOH समाधान का उपयोग करें उसी दिन यह प्रभावी होने के लिए तैयार है।
  6. धीरे से एक 10 मिलीलीटर बाँझ पिपेट का उपयोग कर centrifuged जानवरों से supernatant निकालें. जानवरों के टूटने में सुधार करने के लिए जितना संभव हो उतना एम 9 बफर को हटाने का प्रयास करें।
  7. पशु गोली के लिए ब्लीच + NaOH समाधान के 500 μL जोड़ें और 4 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करें।
  8. या तो हाथ से या एक रॉकर का उपयोग करके, धीरे से जानवरों की गोली को पूरी तरह से तोड़ने के लिए ट्यूब को रॉक करें और जानवरों को ब्लीच + NaOH समाधान में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने दें। पूरे 4 मिनट की अवधि के लिए ट्यूब रॉकिंग जारी रखें।
    नोट: ब्लीच + NaOH समाधान की मात्रा की जरूरत है सिंक्रनाइज़ किया जा रहा पशु गोली के आकार के आधार पर भिन्न हो सकता है। जानवरों और ब्लीच + NaOH समाधान की अलग-अलग मात्रा के साथ पहले से ही इस तकनीक को अनुकूलित करें।
  9. 4 मिनट के बाद, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत तोड़ने की दक्षता की जांच करें। सुनिश्चित करें कि अधिकांश वयस्क जानवर टूट गए हैं, और अंडे सहित उनकी आंतरिक सामग्री जारी की गई है।
  10. यदि जानवरों को विभाजित नहीं किया जाता है, तो संक्षेप में अधिकतम गति से ट्यूब को भंवर करें, फिर माइक्रोस्कोप के नीचे फिर से जांचें।
    नोट: जबकि अंडे ब्लीच + NaOH समाधान के लिए प्रतिरोधी हैं, वे अभेद्य नहीं हैं। अंडे को ब्लीच + NaOH समाधान के संपर्क में नहीं लाया जाना चाहिए, जो आवश्यकता से अधिक समय तक होता है। पशु तोड़ने के कदम के दौरान बहुत लंबे समय तक रुकना संतानों के लिए विकास संबंधी समस्याओं को जन्म दे सकता है।
  11. टूटे हुए पशु समाधान के लिए M9 बफर के 10 mL जोड़ें।
  12. 3 मिनट के लिए 1,000 x g पर अंडे और अवशेषों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  13. Pipette supernatant दूर, सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब के नीचे सभी अंडे युक्त नए गोली को छूने के लिए नहीं कर रही है.
  14. M9 बफर का एक और 10 मिलीलीटर जोड़ें और 1,000 x g पर 3 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. यह सुनिश्चित करने के लिए चरण 2.13-2.14 को दो बार और दोहराएं कि कोई भी ब्लीच + NaOH समाधान नहीं रहता है।
  16. तीसरे M9 बफ़र धोने के बाद, supernatant निकालें और S-बेसल बफर (तालिका 2) के 10 mL जोड़ें।
  17. बफर में समान रूप से अंडे को निलंबित करने के लिए नीचे छर्रे को तोड़ने के लिए ट्यूब को उलटें।
  18. ट्यूब को एक रॉकर पर रखें और धीरे से 20 डिग्री सेल्सियस पर 22 घंटे के लिए ट्यूब को रॉक करें ताकि अंडे को हैच करने और लार्वा चरण 1 (एल 1) गिरफ्तारी तक पहुंचने की अनुमति मिल सके।
  19. 22 घंटे के बाद, 1000 x g पर 3 मिनट के लिए सिंक्रनाइज़ L1 जानवरों वाली ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  20. पिपेट और ट्यूब में बफर के लगभग 1 मिलीलीटर छोड़ने supernatant छोड़ छोड़ दें।
  21. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, शेष बफर में एल 1 जानवरों का एक सजातीय निलंबन बनाने के लिए जानवरों की गोली को परेशान करें।
  22. एल 1 जानवरों के सजातीय निलंबन की एक एकल बूंद को ई कोलाई OP50 के साथ सीडेड 150 मिमी एनजीएम प्लेट लेबल करने के लिए स्थानांतरित करें।
  23. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रति बूंद एल 1 जानवरों की संख्या की गणना करके प्रति बूंद पशु घनत्व की गणना करें। ई कोलाई OP50 की पूरी तरह से उगाए गए लॉन के साथ एक 150 मिमी एनजीएम प्लेट, एल 1 चरण के 500 जानवरों को गुरुत्वाकर्षण वयस्क चरण तक पहुंचने के लिए समर्थन कर सकती है।
  24. ई कोलाई OP50 के साथ छह 150 मिमी NGM प्लेटों के लिए L1 जानवरों को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट को अधिभारित न करें।
    नोट: यदि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या जानवरों के पास एल 1 और ग्रेविड वयस्क के बीच विकास के लिए पर्याप्त भोजन होगा, तो प्रत्येक प्लेट में कम जानवरों को जोड़ें और अधिक प्लेटों का उपयोग करें।
  25. जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए बढ़ने की अनुमति दें जब तक कि वे गुरुत्वाकर्षण वयस्क चरण तक नहीं पहुंच जाते हैं और अंडे देना शुरू नहीं करते हैं।
  26. सिंक्रनाइज़, अच्छी तरह से खिलाया जंगली प्रकार के गुरुत्वाकर्षण वयस्क जानवरों पर ब्लीच सिंक्रनाइज़ेशन का दूसरा दौर करें।
  27. दस 150 मिमी एनजीएम प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ किए गए एल 1 जानवरों को ई कोलाई OP50 के साथ सीड किया गया है, जिसमें प्रति प्लेट लगभग 1,000 जानवर हैं।
  28. नए सिंक्रनाइज़ किए गए L1 जानवरों को 20 °C पर 48 h के लिए बढ़ने की अनुमति दें जब तक कि वे L4 चरण तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: लक्ष्य L4 जानवरों के लगभग 700 - 800 μL गोली प्राप्त करने के लिए है। बहुत सारे जानवरों को बाल्च होमोजेनाइज़र का उपयोग करना मुश्किल हो सकता है; यह मांसपेशियों में तनाव का कारण बन सकता है, जबकि homogenizer और बढ़े हुए दबाव के कारण सिरिंज से संभावित रिसाव ऑपरेटिंग.

3. Balch homogenizer तैयारी

  1. दोनों hypotonic और hypertonic buffers के रूप में तालिका 3 और तालिका 4 में उल्लेख किया तैयार करें.
    नोट: हाइपोटोनिक और हाइपरटोनिक बफ़र्स को पहले से तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 70% इथेनॉल के साथ पीसने वाले कक्ष में बाढ़ करके बाल्च होमोजेनाइज़र को साफ करें, फिर अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ कक्ष को कुल्ला करें।
    नोट:: Balch homogenizer को साफ करने के लिए किसी भी कास्टिक एजेंटों का उपयोग करने से बचें। इथेनॉल और विआयनीकृत पानी के साथ पूरी तरह से कुल्ला करना इसे साफ करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  3. पीसने के कक्ष में 7.9820 मिमी (18 μm गैप क्लीयरेंस) टंगस्टन कार्बाइड गेंद डालें।
  4. Balch homogenizer के बैरल के प्रत्येक छोर कैप और प्रदान की गई थंबस्क्रू के साथ टोपी सुरक्षित.
  5. प्रति नमूना 'पूर्ण हाइपोटोनिक बफर' के 5 एमएल तैयार करें: 1 एम डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 1 एमएम डीटीटी) के 5 μL और 100x प्रोटीज अवरोधक के 100 μL जोड़ें, एकल-उपयोग कॉकटेल (अंतिम एकाग्रता: 2x)। बफर को बर्फ पर रखें।
  6. प्रति नमूना 'पूर्ण हाइपरटोनिक बफर' के 5 एमएल तैयार करें: 1 एम डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 1 एमएम डीटीटी) के 5 μL और 100x प्रोटीज अवरोधक के 100 μL जोड़ें, एकल-उपयोग कॉकटेल (अंतिम एकाग्रता: 2x)। बफर को बर्फ पर रखें।
    नोट:: तैयारी के एक ही दिन पूर्ण hypotonic और hypertonic बफर का उपयोग करें। इसे बाद में उपयोग के लिए स्टोर न करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एकल-उपयोग एलीकोट के रूप में 1 एम डीटीटी स्टोर करें। प्रोटीज अवरोधक एकल-उपयोग कॉकटेल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. 'पूर्ण हाइपोटोनिक बफर' के 1 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ 2 एमएल सिरिंज भरें और धीरे से Balch homogenizer के पीसने कक्ष फ्लश। कक्ष में 'पूर्ण हाइपोटोनिक बफर' के लगभग 500 μL छोड़ दें।
  8. फ्लश किए गए homogenizer को बर्फ पर स्टोर करें और इसे 30 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
    नोट: homogenizer जानवरों को पीसने से पहले बर्फ ठंडा होना चाहिए। पीसने की प्रक्रिया घर्षण के कारण गर्मी पैदा कर सकती है और परमाणु प्रोटीन को डीनेचर कर सकती है। सुनिश्चित करें कि धातु homogenizer बर्फ ठंडा है मदद करने के लिए यह हो रहा है से रोकने के लिए. होमोजेनाइज़र में प्रवेश करने से आसपास की बर्फ के किसी भी पानी से बचना सुनिश्चित करें। homogenizer में छेद प्लग करने के लिए दो बाँझ सिरिंज का उपयोग करें और पीसने कक्ष में प्रवेश करने से किसी भी अनजाने तरल पदार्थ को अवरुद्ध।

4. जानवरों का संग्रह

नोट: एक त्वरित संदर्भ मार्गदर्शिका प्रदान की जाती है, जो जानवरों के संग्रह, व्यवधान और फ्रैक्शनेशन (चित्रा 1) के लिए प्रमुख चरणों को चिह्नित करती है।

  1. एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में M9 बफर के साथ अच्छी तरह से खिलाया L4 जानवरों को ले लीजिए और 3 मिनट के लिए 1000 x g पर जानवरों को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और supernatant स्पष्ट है जब तक जानवर गोली धोने जारी रखें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस हाइपोटोनिक बफर के 3 एमएल के साथ जानवरों को धोएं और 3 मिनट के लिए 1000 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस हाइपोटोनिक बफर के साथ अंतिम धोने के दौरान, जानवर ट्यूब के किनारे से चिपके रह सकते हैं। यह सामान्य है और supernatant को हटाने के दौरान जानवरों की एक छोटी सी हानि में परिणाम हो सकता है।
  3. हाइपोटोनिक बफर को निकालें और जानवरों की गोली के लिए "पूर्ण हाइपोटोनिक बफर" के 1 एमएल जोड़ें। पशु निलंबन को एक नए 2 एमएल बाँझ सिरिंज में स्थानांतरित करें।
    नोट: एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सिरिंज में जानवरों को स्थानांतरित करते समय, धीरे से पिपेट टिप के अंदर कोट करने के लिए एक बाँझ 0.1% ट्वीन 20 समाधान पिपेट टिप के अंदर कोट करने के लिए पिपेट टिप दीवारों से चिपके रहने के कारण खोए गए जानवरों की संख्या को कम करने के लिए।

5. फ्रैक्शनेशन

  1. बर्फ पर, धीरे से 7.9820 मिमी गेंद के साथ भरी हुई Balch homogenizer के पीसने कक्ष के माध्यम से जानवरों को धक्का देकर जानवरों homogenize और एक नई बाँझ सिरिंज में. 30 पूर्ण चक्रों के लिए पीसने वाले कक्ष के माध्यम से जानवरों को धक्का देना दोहराएं।
    नोट: एक 'पूर्ण चक्र' को एक सिरिंज के प्लंजर की पूर्ण ऊपर और नीचे की गति के रूप में परिभाषित किया गया है।
    यह पीसने वाला कदम 7.9820 मिमी गेंद (18 μm बॉल बेयरिंग) का उपयोग करता है।
  2. 30 चक्रों के बाद, Balch homogenizer से जितना संभव हो उतना पशु निलंबन निकालें और सिरिंज को स्टोर करें, 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में टिप करें।
  3. पीसने कक्ष से 7.9820 मिमी गेंद निकालें और विआयनीकृत पानी के साथ इसे साफ करें। सूखी और गेंद को उसके लेबल ट्यूब पर वापस करें।
  4. पीसने कक्ष में 7.9880 मिमी (12 μm गैप क्लीयरेंस) गेंद डालें और homogenizer reseal.
  5. बर्फ के ठंडे 'पूर्ण hypotonic बफर' के 1 मिलीलीटर के साथ पीसने कक्ष फिर से फ्लश।
  6. 25 पूर्ण चक्रों के लिए निलंबन पीस।
  7. 25 चक्रों के बाद, बाल्च होमोजेनाइज़र से पशु निलंबन को हटा दें, निलंबन को एक साफ 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
    नोट: 70% इथेनॉल और विआयनीकृत पानी के साथ Balch homogenizer को अलग और साफ करें। 7.9880 मिमी गेंद को इसकी उचित ट्यूब पर वापस करना सुनिश्चित करें।
  8. 500 x g, 5 मिनट के लिए 4 °C पर निलंबन centrifuging द्वारा पशु निकायों और मलबे गोली.
  9. पिपेट 40 μL supernatant के लिए एक ट्यूब लेबल 'इनपुट अंश' और यह बर्फ पर स्टोर करने के लिए.
    नोट: बाद में उन्हें smearing से बचने के लिए एक अल्कोहल-प्रूफ पेन के साथ सभी लेबल लिखें।
  10. शेष supernatant को एक नई 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, ट्यूब के नीचे गोली को छूने से बचने के लिए ध्यान रखें और फिर गोली को छोड़ दें।
  11. 4,000 x g, 5 मिनट के लिए 4 °C पर नाभिक गोली करने के लिए supernatant सेंट्रीफ्यूज.
  12. supernatant हस्तांतरण, एक नई 1.7 मिलीलीटर ट्यूब के लिए छर्रेदार नाभिक परेशान नहीं करने के लिए सावधान और 'साइटोसोलिक अंश' के रूप में ट्यूब लेबल.
    नोट: किसी भी शेष अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए 17,000 x g, 4 °C पर साइटोसोलिक अंश को आगे बढ़ाएं, और इसे पश्चिमी धब्बों (विशेष रूप से परमाणु प्रोटीन के लिए) के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
  13. 'पूर्ण हाइपोटोनिक बफर' के 500 μL के साथ नाभिक गोली को धोएं और एक नई 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में गोली को स्थानांतरित करें। 4,000 x g, 5 मिनट के लिए 4 °C पर निलंबित गोली centrifuge.
  14. supernatant त्यागें और परमाणु गोली के लिए ताजा 'पूर्ण hypotonic बफर' के 500 μL जोड़ें और एक नई 1.7 mL ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. 4,000 x g, 5 मिनट के लिए 4 °C पर फिर से नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. supernatant निकालें और 'पूर्ण hypertonic बफर' के 40 μL में गोली भंग. नए परमाणु निलंबन को एक नई 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, ट्यूब को 'परमाणु अंश' के रूप में लेबल करें, और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
  16. एक फ्लोरोसेंट परिमाणीकरण किट का उपयोग करके तीन अंशों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: इस विधि से प्राप्त परमाणु प्रोटीन की मात्रा 1-2 μg / μL से हो सकती है।
  17. परमाणु प्रोटीन के 6 μg युक्त एकल उपयोग ट्यूबों में परमाणु अंशों को एलीकोट करें और एक सूखी बर्फ और इथेनॉल स्नान में स्नैप फ्रीज करें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. प्रतिलेखन परख

  1. चालू करें और एक गर्मी ब्लॉक को 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
  2. विट्रो प्रतिलेखन प्रणाली में Nulcear निकालें से निम्नलिखित निकालें: 50 mM MgCl2, परमाणु निकालें 1x प्रतिलेखन बफर, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP, और CMV प्रमोटर सकारात्मक नियंत्रण टेम्पलेट। बर्फ पर पिघलना।
    नोट:: एक उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ का उपयोग कर सकारात्मक-नियंत्रण डीएनए टेम्पलेट को बढ़ाएं और इसे सामान्यीकृत एकल-उपयोग एलीकोट के रूप में संग्रहीत करें।
  3. मिश्रण और एक 10 mM काम समाधान तैयार करने से पहले thawed rNTPs सेंट्रीफ्यूज.
    नोट: प्रत्येक rNTP के 10 mM प्राप्त करने के लिए H2O के 12 μL करने के लिए प्रत्येक rATP, rCTP, rGTP, और rUTP के 2 μL जोड़ें। यदि आवश्यक हो तो इस रचना को बढ़ाया जा सकता है।
  4. एकल-उपयोग ट्यूबों को लेबल करने के लिए rNTP मिश्रण को एलीकोट करें और भविष्य के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. "Mastermix" लेबल वाली एक ताजा 1.5 mL ट्यूब में तालिका 5 में उल्लिखित प्रतिक्रिया के अनुसार अभिकर्मकों को जोड़ें
  6. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए Mastermix के 14 μL स्थानांतरण
  7. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1x प्रतिलेखन बफर के 11 μL माइनस (परमाणु निकालने के 5 μg के लिए मात्रा) जोड़ें।
  8. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए परमाणु निकालने के 5 μg जोड़ें।
  9. धीरे से प्रतिक्रिया ट्यूब के अंदर सामग्री मिश्रण और नाड़ी मिश्रण के बाद ट्यूबों centrifuge नल यह सुनिश्चित करने के लिए कोई प्रतिक्रिया सामग्री ट्यूब की दीवार के लिए अटक गया है सुनिश्चित करने के लिए.
  10. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
  11. आरएनए निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान किए गए आरएलटी बफर के 400 μL को जोड़कर तुरंत प्रतिक्रिया को रोकें।
    नोट:: इस बिंदु पर, यह रोकने के लिए सुरक्षित है। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आरएनए निष्कर्षण किट के साथ आगे साफ न हो जाए।

7. आरएनए साफ अप

  1. DNase मैं आरएनए निष्कर्षण किट में प्रदान की गई RNase मुक्त DNase सेट का उपयोग कर स्टॉक समाधान तैयार करें। RNase मुक्त पानी के 550 μL में lyophilized DNase I को भंग करें। धीरे से समाधान मिश्रण. भंवर मत करो। 10 μL एकल उपयोग ट्यूबों में DNase I समाधान को एलीकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट स्टोर करें।
  2. आणविक ग्रेड इथेनॉल और RNase मुक्त पानी का उपयोग करके 70% और 80% इथेनॉल तैयार करें।
  3. क्लीन-अप प्रारंभ करने से पहले नमूने और अभिकर्मकों को RNase-मुक्त कार्यस्थान पर ले जाएँ.
  4. प्रत्येक नमूने के लिए 70% इथेनॉल के 400 μL जोड़ें और धीरे से pipette अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
  5. एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब के साथ एक लेबल आरएनए निष्कर्षण स्पिन कॉलम के लिए नमूने के 400 μL स्थानांतरण और 30 s के लिए 8,500 x g पर नमूने centrifuge. प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  6. शेष नमूने के साथ चरण 7.5 दोहराएँ और प्रवाह के माध्यम से छोड़ दें।
  7. प्रत्येक स्तंभ के लिए RW1 बफर (आरएनए निष्कर्षण किट) के 350 μL जोड़ें। 30 s के लिए 8,500 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  8. DNase I स्टॉक समाधान के एक एकल 10 μL ऐलीकोट में RDD बफर (आरएनए निष्कर्षण किट) के 70 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण करें। भंवर मत करो।
  9. DNase मैं मिश्रण (80 μL) सीधे स्पिन स्तंभ झिल्ली के लिए इनक्यूबेशन जोड़ें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्तंभों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: झिल्ली के लिए DNase I समाधान जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें। स्तंभ दीवार या ओ-रिंग के समाधान का हिस्सा खोने से बचें।
  10. 15 मिनट के बाद, स्तंभों के लिए RW1 बफ़र के 350 μL जोड़ें। 8,500 x g पर 30 s के लिए सेंट्रीफ्यूज । प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  11. स्तंभों को नए 2 mL संग्रह ट्यूबों में रखें. स्पिन स्तंभ के लिए RPE बफ़र (आरएनए निष्कर्षण किट) के 500 μL जोड़ें। झिल्ली को धोने के लिए 30 s के लिए 8,500 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  12. प्रत्येक कॉलम में 80% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें और 30 s के लिए 8,500 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  13. स्तंभों को नए 2 mL संग्रह ट्यूबों में रखें. कॉलम ढक्कन को खुला छोड़कर, 5 मिनट के लिए 17,900 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  14. स्तंभों को लेबल किए गए 1.7 एमएल ट्यूबों में रखें। स्पिन कॉलम झिल्ली के केंद्र में सीधे RNase-मुक्त पानी के 17 μL जोड़ें। स्तंभों को 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम करने दें। 1 मिनट के लिए 17,900 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. कॉलम को छोड़ दें और ताजा शुद्ध आरएनए नमूने के साथ 1.7 एमएल ट्यूब रखें।

8. डीएनए पाचन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और 65 डिग्री सेल्सियस पर दो गर्मी ब्लॉकों को प्रीहीट करें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 10x प्रतिक्रिया बफर के 2 μL जोड़ें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए DNase के 1 μL (1 MBU) जोड़ें।
  4. 10 μL करने के लिए एक पिपेट सेट करें और धीरे से मिश्रण करने के लिए नए समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें। भंवर मत करो।
  5. किसी भी शेष डीएनए को पचाने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  6. 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक पर नमूनों incubating द्वारा DNase निष्क्रिय.
    नोट:: इस चरण पर रोकने के लिए और बाद में रिवर्स प्रतिलेखन करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर करने के लिए सुरक्षित है।

9. रिवर्स प्रतिलेखन

  1. थर्मोसाइकिलर को प्रोग्राम करते समय, थर्मोसाइकिलर को प्रीहीट करने के लिए इनक्यूबेशन से पहले एक अतिरिक्त 1 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस कदम जोड़ें। नमूनों को तैयार करते समय 'प्रीहीट चरण' के साथ कार्यक्रम चलाएं और थर्मोसाइकलर को 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने दें। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए नमूने तैयार होने पर, 37 डिग्री सेल्सियस प्रीहीट चरण को छोड़ दें और वास्तविक इनक्यूबेशन चरण (तालिका 6) पर आगे बढ़ें। यदि थर्मोसाइकलर में एक स्किप सुविधा नहीं है, तो इनक्यूबेशन से पहले 1 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस चरण जोड़ें। थर्मोसाइकलर को सिस्टम को रोकने और तैयार नमूनों को जोड़ने से पहले उचित तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें।
  2. RNase-मुक्त H2O में प्रतिलेखन रिवर्स प्राइमर का एक 10 μM काम करने वाला समाधान तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
  3. बर्फ पर पिघलना, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट से 10x बफर, dNTP मिश्रण (5 mM प्रत्येक dNTP), RNase Inhibitor, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज।
  4. तालिका 7 में उल्लिखित घटकों को एक साफ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में जोड़कर एक मास्टरमिक्स (प्रति प्रतिक्रिया) तैयार करें।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए नए 0.2 mL पीसीआर ट्यूबों में Mastermix के 18 μL ऐलीकोट.
  6. DNase के 2 μL जोड़ें उनके क्रमशः लेबल ट्यूबों में प्रत्येक नमूने के लिए आरएनए का इलाज किया।
  7. एक preheated thermocycler में 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद भंडारण के लिए नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं या सीधे अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    नोट:: यह इस चरण पर रोकने के लिए सुरक्षित है; बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर cDNA स्टोर करें।

10. विशिष्ट उत्पाद प्रवर्धन

  1. बर्फ पर पिघलना: cDNA, 10 μM प्रतिलेखन आगे और 10 μM प्रतिलेखन रिवर्स प्राइमर, और पीसीआर 2x प्रीमिक्स ए।
    नोट: पीसीआर 2x Premix A को पिघलने के समय को कम करने के लिए छोटे वॉल्यूम में एलीकोट करें।
  2. तालिका 8 में उल्लिखित घटकों को एक साफ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में जोड़कर एक मास्टरमिक्स (प्रति प्रतिक्रिया) बनाएं।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए मास्टरमिक्स के 24 μL को साफ लेबल 0.2 mL PCR ट्यूबों में एलीकोट करें।
  4. उनके संबंधित ट्यूबों में प्रत्येक नमूने के cDNA के 1 μL जोड़ें।
  5. तालिका 9 में उल्लिखित प्रोग्राम शर्तों का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करें
  6. इनक्यूबेशन के बाद, पीसीआर उत्पादों को लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

11. जेल विश्लेषण

  1. एक जेल तैयार करने के लिए 1x TAE बफर का उपयोग करें जिसमें agarose और 1x जेल दाग के 2% w / v होते हैं।
  2. पीसीआर उत्पादों को 1 घंटे के लिए 50 वी और 300 एमए पर चलाएं या जब तक कि एक स्पष्ट बैंड पृथक्करण न हो।
  3. जेल इमेजर में प्रीलोडेड स्वचालित एक्सपोज़र प्रोग्राम का उपयोग करके जेल की छवि।

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Representative Results

उल्लिखित चरणों के बाद कार्यात्मक परमाणु अर्क (चित्रा 1) उपज चाहिए, पीसने या धोने के चरणों में विचलन खराब गतिविधि या कम पैदावार का कारण बन सकता है। यदि कार्यात्मक C. elegans परमाणु निकालने प्राप्त किया जाता है, तो यह डीएनए टेम्पलेट पर सीएमवी प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम क्षेत्र को ट्रांसक्राइब करेगा जब पहले से विट्रो परख में वर्णित में जोड़ा जाएगा। परिणामी आरएनए प्रतिलेख को पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके परमाणु प्रोटीन और डीएनए टेम्पलेट से शुद्ध किया जा सकता है। टेम्पलेट डीएनए के बिना, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और बाद के पीसीआर उत्पाद केवल परमाणु अर्क द्वारा ट्रांसक्रिप्ट किए गए आरएनए का परिणाम हो सकते हैं। पीसीआर उत्पादों को एक एगारोज़ जेल पर कल्पना की जा सकती है, डीएनए बैंड की तीव्रता परमाणु प्रोटीन और आरएनए अलगाव की गुणवत्ता का संकेत हो सकती है। एक कमजोर बैंड तीव्रता परमाणु निकालने की निष्क्रियता के कारण या तो गर्मी या खराब बफर तैयारी के कारण हो सकती है। एक अत्यधिक मजबूत बैंड तीव्रता डीएनए संदूषण का परिणाम हो सकती है या तो खराब आरएनए शुद्धिकरण या अनुचित डीएनएस पाचन के कारण हो सकती है। सुसंगत और सफल परमाणु अलगाव समान तीव्रता के बैंड का उत्पादन करेंगे, और ट्रांसक्रिप्शनल और पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण दोनों में कोई दृश्यमान पीसीआर उत्पाद नहीं होना चाहिए (चित्रा 2)।

Figure 1
चित्र 1. नाभिकीय अर्क अलगाव की एक रूपरेखा। फ़्लोचार्ट C. elegans से परमाणु निकालने को अलग करने के लिए प्रमुख चरणों को रेखांकित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. C. elegans परमाणु निकालने अपनी गतिविधि को बनाए रखता है. जेल छवि सीएमवी प्रमोटर डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर C. elegans L4 लार्वा परमाणु निकालने के प्रतिलेखन उत्पादों से पता चलता है. सक्रिय परमाणु प्रोटीन के सफल अलगाव के परिणामस्वरूप इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद 132 बीपी पीसीआर उत्पाद होगा, जैसा कि लेन 1 और 2 में देखा गया है। असफल अलगाव के परिणामस्वरूप एक कमजोर बैंड या लेन 3 के समान पीसीआर उत्पाद की अनुपस्थिति होगी। पीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से प्रतिलेखन गतिविधि का यह विज़ुअलाइज़ेशन परमाणु निष्कर्षण अलगाव की गुणवत्ता का आकलन करने का एक सरल तरीका है। सकारात्मक पीसीआर नियंत्रण पीसीआर प्रतिक्रिया में सीएमवी प्रमोटर डीएनए टेम्पलेट को जोड़कर उत्पादित किया जाता है, और नकारात्मक नियंत्रण में टेम्पलेट डीएनए की कमी होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सूत्रकृमि विकास मीडिया प्लेट्स
आगर 20.4 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 2.8 ग्राम
Bacto पेप्टोन 2.3 ग्राम
dH2O 975 mL
30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव
निम्न जोड़ने से पहले मीडिया को 50 °C तक ठंडा करने की अनुमति दें
1 M CaCl2 (बाँझ) 1 मिलीलीटर
1 M MgSO4 (बाँझ) 1 मिलीलीटर
10,000 इकाइयों / mL Nystatin (बाँझ) 3 mL
95% इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल (फ़िल्टर निष्फल) 1 मिलीलीटर
1M KPO4 pH 6.0 (बाँझ) 25 mL

तालिका 1.

M9 बफ़र
KH2PO4 3 ग्राम
Na2HPO4 6 ग्राम
NaCl 5 ग्राम
dH2O 1,000 mL
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव
1 M MgSO4 (बाँझ) 1 मिलीलीटर (ऑटोक्लेविंग के बाद जोड़ें)
एस-बेसल बफर
KH2PO4 6 ग्राम
K2HPO4 1 g
NaCl 5.85 ग्राम
dH2O 1,000 mL
15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव
कोलेस्ट्रॉल 5 मिलीग्राम / एमएल (बाँझ) 1 मिलीलीटर (ऑटोक्लेविंग के बाद जोड़ें)

तालिका 2.

हाइपोटोनिक बफर
स्टॉक समाधान आयतन अंतिम एकाग्रता
1 एम HEPES KOH पीएच 7.6 7.5 mL 15 mM
1 M KCl 5.0 mL 10 mM
1 M MgCl2 2.5 mL 5 mM
0.5 M EDTA 0.1 मिलीलीटर 0.1 mM
1 M सुक्रोज 175 mL 350 mM
dH2O 309.9 mL
फ़िल्टर निष्फलीकरण

तालिका 3.

हाइपरटोनिक बफर
स्टॉक समाधान आयतन अंतिम एकाग्रता
1 एम HEPES KOH पीएच 7.6 7.5 mL 15 mM
1 M KCl 200 mL 400 mM
1 M MgCl2 2.5 mL 5 mM
0.5 M EDTA 0.1 मिलीलीटर 0.1 mM
10% Tween 20 5 mL 0.10%
50% ग्लिसरॉल 100 mL 10%
dH2O 184.9 mL
फ़िल्टर निष्फलीकरण

तालिका 4.

MgCl2, 50 mM 1.5 μL
rNTP मिश्रण, 10 mM प्रत्येक 1.0 μL
टेम्पलेट डीएनए, 25 ng/ 4.0 μL
RNase मुक्त H2O 7.5 μL

तालिका 5.

क़दम तापमान समय चक्र संख्या
प्रीहीट 37 °C 60 मिनट 1x
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन 37 °C 60 मिनट 1x
पकड 10 °C 1x

तालिका 6.

10x रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफ़र 2.0 μL
dNTP मिश्रण (5 mM प्रत्येक dNTP) 2.0 μL
प्रतिलेखन रिवर्स प्राइमर (10 μM) 2.0 μL
RNase अवरोधक 1.0 μL
Sensiscript रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज 1.0 μL
RNase मुक्त H2O 10.0 μL

तालिका 7.

RNase-मुक्त H2O 6.25 μL
प्रतिलेखन फॉरवर्ड प्राइमर (10 μM) 2.5 μL
प्रतिलेखन रिवर्स प्राइमर (10 μM) 2.5 μL
PCR 2X Premix A 12.5 μL
पीसीआर एंजाइम मिश्रण 0.25 μL

तालिका 8.

क़दम तापमान समय चक्र संख्या
प्रारंभिक डीनेचर 92 °C 60 सेकंड 1x
विच्छेद 92 °C 30 सेकंड
Annealal 59 °C 30 सेकंड 35x
विस्तार 72 °C 30 सेकंड
पकड 10 °C 1x

तालिका 9.

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Discussion

C. elegans यूकेरियोटिक प्रतिलेखन प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है क्योंकि इसकी कम लागत वाले रखरखाव और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी है। यहाँ L4 C. elegans से कार्यात्मक रूप से सक्रिय परमाणु निकालने के लगातार अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल प्रतिलेखन गतिविधि को विज़ुअलाइज़ करने पर केंद्रित है, लेकिन ट्रांसक्रिप्शन गतिविधि 8 का अधिक सटीक माप प्राप्त करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से उत्पादित सीडीएनए को निर्धारित किया जा सकता है। सी एलिगन्स से परमाणु प्रोटीन को अलग करने की यह विधि यूकेरियोटिक प्रतिलेखन मशीनरी के अध्ययन का विस्तार करने में मदद कर सकती है। चूंकि C. elegans एक पकवान या खमीर की कॉलोनी में कोशिकाओं की संस्कृति नहीं है, बल्कि एक मुक्त रोमिंग जानवर है, इसके परमाणु अर्क को अलग करने और शोध करने से एक स्पष्ट अंतर्दृष्टि मिल सकती है कि ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी समय के साथ या विभिन्न वातावरणों में कैसे बदल सकती है। यह शोधकर्ताओं को सी एलिगन्स की कम लागत और लचीलेपन का लाभ उठाने की अनुमति देता है। C. elegans, अन्य मॉडल जीवों या सेल संस्कृतियों के विपरीत, बैक्टीरिया या खमीर संदूषण दिखाई देने पर बहुत अधिक क्षमाशील होता है। C. elegans की आबादी को स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके आसानी से संदूषण से साफ किया जा सकता है, जब संदूषण होता है तो समय और प्रयास की बचत होती है। कुल मिलाकर, जैव रासायनिक assays के लिए C. elegans से परमाणु निकालने का उपयोग करना एक विक्रेता से परमाणु निकालने की खरीद या कम क्षमाशील मॉडल जीवों से निपटने की तुलना में एक अधिक किफायती और लचीला विकल्प हो सकता है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, फिर भी महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें परमाणु अर्क के सफल अलगाव के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। यह महत्वपूर्ण है कि पूर्ण हाइपोटोनिक और हाइपरटोनिक बफर की तैयारी के दौरान, दो समाधानों को स्पष्ट रूप से लेबल और अलग किया जाता है। यदि अलगाव के दौरान बफर को किसी भी बिंदु पर स्विच किया जाता है, तो इससे परमाणु प्रोटीन की निष्क्रियता या परमाणु प्रोटीन से साइटोसोलिक प्रोटीन का खराब फ्रैक्शनेशन हो सकता है। पृथक परमाणु प्रोटीन भी, यदि आवश्यक हो, तो हाइपरटोनिक बफर में पतला किया जाना चाहिए, न कि पानी या किसी अन्य समाधान में। उच्च नमक एकाग्रता प्रोटीन की गतिविधि को संरक्षित करने में मदद करती है, और एक हाइपोटोनिक समाधान इस गतिविधि को मार सकता है10।

एक और चुनौती जो इस प्रोटोकॉल के पीसने वाले हिस्से के दौरान उत्पन्न हो सकती है, टंगस्टन गेंदों की सतह का पालन करने वाले मलबे से आती है। जबकि यह कहा गया है कि गेंदों को हर पीसने वाले चक्र के बाद धोया और सुखाया जाना चाहिए, सामग्री गेंदों की चिकनी सतह से जुड़ी होगी। यह सामग्री आमतौर पर गेंदों की परिधि के चारों ओर जंग के रंग के छल्ले के रूप में दिखाई देती है और गेंद और पीसने वाले कक्ष की दीवार के बीच के अंतर को अवरुद्ध करने के लिए पर्याप्त मोटी होती है। यह रुकावट ध्यान देने योग्य है क्योंकि यह चक्की के माध्यम से जानवरों को धक्का देने के लिए अधिक से अधिक कठिन हो जाता है, जो अंततः मांसपेशियों की चोट या सिरिंज के टूटने का कारण बन सकता है। यदि टंगस्टन गेंदों को मलिनकिरण दिखाना शुरू हो जाता है, तो उन्हें 5 मिनट के लिए गर्म पानी में भिगोएं, फिर एक नए परिमार्जन पैड के साथ सतह को साफ करें। अम्लीय या बुनियादी सफाई समाधान का उपयोग करने से बचें। धीरे से चमकाने के बाद, टंगस्टन गेंदों को अपनी मूल चमक पर वापस आना चाहिए, और नमूनों को पीसना काफी आसान होगा।

इस प्रोटोकॉल को C. elegans से पूरे परमाणु निकालने को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह अन्य मॉडल जीवों पर उपयोग के लिए परीक्षण नहीं किया गया है। अन्य जीवों से परमाणु निकालने के लिए विभिन्न बफ़र्स की आवश्यकता हो सकती है, और सीएमवी प्रमोटर अन्य गैर-स्तनधारी नमूनों में प्रतिलेखन को चलाने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इस विधि का उपयोग करके एकत्र परमाणु अर्क भी ऊतक या सेल-विशिष्ट नहीं है; इस विधि का उपयोग करके मापा गया कोई भी प्रतिलेखन गतिविधि जानवरों को एक पूरे के रूप में देखती है जो ऊतकों के बीच सूक्ष्म परिवर्तनों को छिपा सकती है।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के उपयोग डीएनए क्षति के बाद सी एलिगन्स की डीएनए मरम्मत या प्रतिकृति मशीनरी को माप सकते हैं। अलगाव प्रक्रिया के दौरान एकत्र किए गए साइटोसोलिक अंश का उपयोग घुलनशील प्रोटीन की मात्रा को मापने और प्रतिलेखन को मापने के समान तरीके से इन प्रोटीनों की गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को एक NIH MIRA अनुदान (R35GM124678 J. S. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear Genesee Scientific  24-706
0.2 mL Individual PCR tubes Genesee Scientific  24-153G
1.7 mL sterile microtubes Genesee Scientific 24-282S
100% absolute molecular grade ethanol Fisher Scientific  BP2818
100% ethanol, Koptec Decon Labs  V1001
10 mL serological pipet VWR international  89130-898
150 mm petri plates Tritech Research  T3325
15 mL conical centrifuge tubes Genesee Scientific  28-103
20 mL plastic syringes Fisher Scientific 14955460
2 mL Norm-Ject syringes Henke-Sass Wolf GmbH 4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus Millipore Sigma SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 339652
50 mL serological pipet VWR international  89130-902
5 mL serological pipet VWR international  89130-896
Agar, Criterion VWR International  C7432
Agarose Denville Scientific  CA3510-6
Alcohol proof marker VWR International  52877-310
Bacto peptone VWR International  90000-264
Caenorhabditis elegans CGC N2
Calcium dichloride Millipore Sigma  C4901
Cholesterol Millipore Sigma  C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol Invitrogen  15508-013
DNA gel stain, SYBR safe Invitrogen  S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler Fisher Scientific  SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack Fisher Scientific  FERR1161
DNase, Baseline-ZERO Lucigen  DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain CGC OP50
Glacial acetic acid Fisher Scientific  A38
Glycerol Millipore Sigma  G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe Promega  E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco Millipore Sigma 15630080
Hydrochloric acid 37% Millipore Sigma  P0662
Hypochlorite bleach Clorox
LB Broth Millipore Sigma  L3022
Magnesium dichloride Millipore Sigma  M8266
Magnesium Sulfate Millipore Sigma  M7506
Medium weigh dishes Fisher Scientific  02-202-101
microscope slides, Vista vision VWR International 16004-368
molecular grade water, Hypure Hyclone Laboratories  SH30538
Nystatin Millipore Sigma  N1638
PCR system, FailSafe with premix A Lucigen  FS99100
Potassium chloride Millipore Sigma  P39111
Potassium phosphate dibasic Millipore Sigma  P3786
Potassium phosphate monobasic Millipore Sigma  P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x ThermoFisher Scientific 78430
protein assay kit, Qubit ThermoFisher Scientific  Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript Qiagen 205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit Qiagen 74004
RNase Inhibitor Applied Biosystems  N8080119
Sodium Chloride VWR International  BDH9286-12KG
Sodium hydroxide Millipore Sigma  1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane VWR international 28145-501
Sucrose VWR International  200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base Fisher Scientific  BP152
Tween20 Millipore Sigma  P2287
Equipment
-20 °C incubator ThermoFisher Scientific
20 °C incubator ThermoFisher Scientific
37 °C incubator Forma Scientific
4 °C refrigerator ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer Eppendorf
Autoclave Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer Isobiotec
Benchtop Vortexer Fisher Scientific 2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R Eppendorf 5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50 VWR International 82013-800
Dissection microscope, Leica M80 Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0 Invitrogen Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500 ThermoFisher Scientific  A44241
Gel system ThermoFisher Scientific
Heat block VWR International 12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424 Eppendorf 22620401
PIPETBOY acu 2 Integra 155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS Rainin 17014392
Rocking platform VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro Eppendorf 950030010

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References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
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  3. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).
  4. Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
  5. Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
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जैव रसायन मुद्दा 174 सी elegans परमाणु निकालने इन विट्रो प्रतिलेखन Balch homogenizer गैर रेडियोधर्मी का पता लगाने
सक्रिय <em>Caenorhabditis elegans</em> परमाणु निकालें और <em>इन विट्रो</em> प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव
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Wibisono, P., Sun, J. Isolation of… More

Wibisono, P., Sun, J. Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription. J. Vis. Exp. (174), e62723, doi:10.3791/62723 (2021).

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